Triagem para Modificações Genômicas: Um Método para Identificar Mutantes Gerados por CRISPR em Drosophila

Overview

Este vídeo descreve um método de triagem para identificar moscas transgênicas de Drosophila, cujo genoma foi modificado usando CRISPR-Cas9. O CRISPR-Cas9 é uma poderosa ferramenta de edição de genomas que revolucionou a forma como os cientistas podem manipular o genoma de um organismo. No protocolo de exemplo, veremos como identificar mutantes gerados pelo CRISPR, nos quais uma inserção de uma sequência de transativação substitui o primeiro exon do gene sem ramificações (bnl),criando assim uma linha de driver específica de genes bnl, bnl-LexA.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Du et al., Uma Estratégia Eficiente para Gerar Sistemas de Transcrição Binária específicos de tecido em Drosophila por Edição de Genoma, J. Vis. Exp. (2018).

1. Genética de moscas e triagem (Figura 1 e Figura 2)

1. Quando os embriões injetados se desenvolvem em adultos, cruze cada G₀ voa para balançar moscas. Selecione o balanceador adequado para o cromossomo contendo o alelo direcionado.
2. Anestesiar a prole F1 de cada G0 cruz em uma almofada de CO₂ e escolher aleatoriamente 10-20 machos sob um estereóscópio. Cruze-as individualmente para as fêmeas balanceadoras, como mostrado na Figura 2.
3. Quando as larvas F2 chocarem, escolha o único pai F1 de cada cruz e extraia gDNA usando o protocolo de preparação de DNA genômico de mosca única:
   1. Prepare o tampão de extração gDNA: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, armazenar à temperatura ambiente. Prepare a solução de estoque Proteinase K de 20 mg/mL e armazene no congelador.
   2. Coloque cada mosca em um tubo de micro centrífugas de 1,5 mL e rotule o tubo. Mantenha no congelador -80 °C durante a noite.
   3. Prepare um novo volume de trabalho do tampão de extração gDNA contendo 200 μg/mL de concentração final de Proteinase K.
      Nota: Não use um buffer antigo para esta etapa.
   4. Esmague cada mosca por 10-15 s com uma ponta de pipeta contendo 50 μL de tampão de squishing sem dispensar o líquido. Distribua o tampão restante no tubo e misture bem. Incubar a 37 °C por 20-30 min.
   5. Coloque tubos em bloco de calor de 95 °C por 1-2 min para inativar o Proteinase K.
   6. Gire para baixo por 5 min a 10.000 x g. Armazene a preparação a 4 °C para análise suplementar de PCR.
4. Use o mesmo método para preparar gDNA de uma mosca nos-Cas9, que serve como um controle negativo. Execute telas baseadas em PCR de três etapas para identificar o HDR correto "termina"(Figura 1, Figura 3) usando gDNA de cada f1 masculino como modelo⁵. Use 1 μL da preparação de DNA no seguinte sistema de reação PCR: 10 μL de 2x PCR Master Mix com Corante, 1 μL de cada primer (10 μM), 1 μL de modelo de DNA e 7 μL de ddH₂O.
5. Como mostrado na Figura 3A,execute PCR utilizando primers fwd1 e rev1 para tela para a existência da inserção ou substituição; realizar PCR utilizando primers fwd2 e rev2 para verificar a inserção ou substituição da região de 3'; executar PCR usando primers M13F e rev3 para verificar "ends-in" HDR(Tabela 1C).
6. Mantenha as linhas de voo com o HDR de extremidades confirmados e estabeleça estoques equilibrados da geração F2. O cruzamento para o balanceador voa novamente para remover qualquer mutação não intencional em outros cromossomos.

Representative Results

Figura 1: Uma visão geral do fluxo de trabalho para a edição de genoma mediada pelo CRISPR/Cas9 para gerar um sistema de transcrição binária. A duração aproximada do tempo necessária para cada etapa é indicada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Uma ilustração da triagem CRISPR e do esquema de cruz genético para o estabelecimento de linhas de mosca editadas por genoma. Em cruzes genéticas, R significa o alelo editado que está no cromossomo 3^rd. MKRS (Tp(3;3)MRS, M(3)76A[1] kar[1] ry[2] Sb[1]), é um marcador cromossomo 3^rd; TM6B (In(3LR)TM6B, Antp[Hu] e[1] Tb[1]) é um equilibrador de cromossomo de 3^rd. Os estoques de moscas editados pelo genoma são verificados por PCR amplificando as regiões-alvo de interesse do DNA genômico extraído das moscas da geração F2 ou F3 e sequência determinando os produtos PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Geração de bnl-LexA por substituição de exon mediada pela CRISPR/Cas9. (A) Desenho esquemático representando a estratégia do HDR mediado CRISPR/Cas9 para substituição de exon no lócus bnl. Caixa - exon; linha-intron; foram mostrados doadores substitutos(pDonor-bnl:LexA) e dois possíveis desfechos do HDR. A sequênciapDonor-bnl:LexA tinha as seguintes características: (1) T2A-nls-LexA:p65 (~1,8kb) sequência ladeada por braços de escoriação de 2 kb e 1,8 kb de comprimento (linhas tracejadas ), (2) um peptídeo de auto-fissuração T2A entre o exon residual n terminal bnl e o nls-LexA:p65, e (3) um codon de tradução (vermelho *) após a sequência nls-LexA:p65. Espera-se que o produto HDR tenha mantido todo o controle transcricional e pós-transcricional do bnl,e espera-se que a proteína LexA:p65 seja produzida no mesmo padrão que o Bnl. Pequenas setas pretas mostram os locais relativos de ligação (não em escala) das primers PCR(Tabela 1) usadas para triagem de 3 passos ou validação RT-PCR. (B) Imagens em gel de agarose mostrando resultados da triagem pcr de 3 etapas. Os produtos PCR amplificados a partir do DNA genômico de quatro linhas HDR de extremidades bem sucedidas são mostrados; controle negativo, o DNA genômico da linha parental nos-Cas9; controle positivo,pDonor-bnl:LexA plasmid; M, Marcador (escada de DNA SL2K). (C) Um exemplo do gel de triagem mostrando o produto PCR esperado usando primers M13F e rev3 para linhas de final; M8-7 e M9-6 são duas linhas de ponta; controles negativos e positivos, os mesmos de B; M, Marcador (escada de DNA NEB 1 kb). (D) Análise RT-PCR sobre RNA total de bnl-LexA e o controle nos-Cas9 voa. Primer forward liga-se a uma região específica lexa, primer reverso liga-se a uma região de bnl exon a jusante; ~440 bp (base-pair) banda de amplificação (*) foi detectada a partir de RT-PCR em bnl-LexAmRNA, mas não do RNA de controle. M, 100 bp Marcador (NEB). Adaptado das Figuras 2 e S1 em Du et al. 2017. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A. clonagem e sequenciamento de gRNA
bnl-lexA gRNA fwd	TATATAGGAAAGATATCCGGGTGAACTTCgTGTATCTGCGAT
	GCCCCTCAGTTTTAGAGAGAAATAGCAAG
bnl-lexA gRNA rev	ATTTTAACTTGCTATTTCTAAAACTCCCCCCAATATCTGAAGG
	ATCGACGTTAAATTGAAAAATAGGTC
Primer T3 usado para sequenciamento	CAATTA ACCCTCACTAAAGG-3'
NOTA: nucleotídeos sublinhados anneal para U6 promotor ou núcleo gRNA no vetor pCFD4, o g/c minúscula foi adicionado para ajudar a transcrição dependente do promotor U6
B. Construção de doadores HDR
bnl N-F_pUC19	AATTCGAGCGGGGTACtggtctttgaggctggaac
bnl-lexA-N-R	tCCGcaagtCagtAGgctgccccttcccccgggga GCCCGCAGATACAAGGCCCCCC
lexA-F	CTactGacttgCGGaGGTcGAaGAGAACCCtGGC CCtATGCCACCCAAGAAGAAGC
lexA-R	CTAAACGAGTTTTTAAGCAAACTCACTC
bnl lexA-C Fwd	TAAAAACTCGTTTAGACGGGGCGTTGTCAAC
bnl C-R_pUC19	GCCAAGCTTGCATGCCtcgcataattgccgcctgg
NOTA: nucleotídeos na sobreposição de capital com vetor pUC19 para Gibson Assembly, nucleotídeos sublinhados foram saliência sequência para adição de peptídeos T2A.
C. Triagem e sequenciamento HDR
bnl-lexA scr fwd1	GTGGCGCACCCAATAAAC
bnl-lexA scr rev1	GATCCCAGCCAATCTCCGTTG
bnl-lexA scr fwd2	CAACGGAGATTGGCTGGGATC
bnl-lexA scr rev2	CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC
verificação de fim de entrada rev3	GCAATGTTATGCAATGCGTTGAC
bnl-lexA seq fwd3	CACTTGTCGCCCATATTGATACAATTATTG
NOTA: Estes primers foram usados para triagem e sequenciamento pcr, os locais aproximados de sites de ligação primer são mostrados na Figura 5A como fwd1-2 e rev1-3.
Análise D. RT-PCR
RT-f	GATATGGATTTCTCCGCTTTGCTGCTGGGGGGGG
RT-r	CCATGCAGAGATACAGGCAAGTG

Tabela 1: Primers utilizados neste estudo. (A) Primers para clonagem de vetor de expressão gRNA e sequenciamento. (B) Primers para clonagem de modelo de doador HDR. (C) Primers para triagem e sequenciamento dos produtos HDR. (D) Primers utilizados para verificação RT-PCR do produto quimérico LexA-bnl mRNA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
Primers	IDT-DNA		PCR
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation