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Encyclopedia of Experiments

화학 건조: 전자 현미경 검사(SEM) 스캔을 위한 생물학적 샘플 준비

Overview

전자 현미경 검사법(SEM)을 스캔하는 것은 생물학적 샘플의 표면 특징인 이미지에 대한 강력한 도구입니다. 그러나 적절한 샘플 준비는 품질 이미지를 얻는 데 중요합니다. 이 비디오는 SEM에 대한 그대로 성인 Drosophila를 준비하는 탈수 및 건조 단계에 초점을 맞추고 있습니다.

Protocol

이 프로토콜은 Koon 외.에서 발췌, 전자 현미경 검사 (SEM), J. Vis. Exp. (2019)에서 형태학적 분석을위한 화학 건조를 사용하여 프로카르요틱 및 진핵 생물의 준비.

1. 준비 및 고정

  1. 드로소필라 멜라노가스터(과일 파리)를 준비한다.
    1. 100% 이산화탄소를 사용하여 성인 파리를 마취합니다. 작은 플라스틱 나사 캡 바이알 또는 1.5 mL 원심 분리 튜브에 마취 된 성인 (약 10 ~ 30 파리)을 놓습니다.
    2. 마취플라이는 4°C에서 2시간(또는 하룻밤)에 1mL의 고정(1.25% 글루타랄데히드, 0.1M 인산염 완충 pH 7.2)으로 침수한다. 파리가 고정물의 표면에 떠있는 경우, 조직의 총 침전을 허용하는 고정의 표면 장력을 약화시키기 위해 2.5 % 폴리에틸렌 글리콜 테르트 - 옥티펜닐 에테르의 몇 방울을 추가합니다. 유리 파이프를 사용하여 고정을 제거합니다.

2. 세척 및 탈수

  1. 드로소필라 멜라노가스터(과일 파리)를 세척하고 탈수합니다.
    1. 1.5mL 마이크로센트리슈지 튜브에서 10분 동안 실온에서 0.1M 인산염 완충p pH 7.2의 1mL로 고정 시료를 3회 세척한다. 유리 파이펫으로 각 세척을 제거하여 파리를 제거하지 않도록 주의하십시오.
    2. 마이크로퓨지 튜브에서 1mL의 부피에서 10분 동안 등급이 매겨진 에탄올 계열을 사용하여 샘플을 탈수합니다. 에탄올 농도는 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%이다. 유리 파이펫으로 에탄올을 제거하고 파리를 제거하지 않도록 주의하십시오.
    3. 건조하기 전에 시료를 커버할 수 있는 충분한 100% 에탄올로 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 샘플을 유지합니다.

3. 건조

  1. hexamethyldisilazane (HMDS)를 사용하여 화학 건조를 수행합니다.
    1. 100% 에탄올 용액을 HMDS 1:2 솔루션과 100% 에탄올로 20분 동안 교체합니다. 1:2 솔루션을 HMDS 용액 2:1 및 100% 에탄올로 20분 동안 교체합니다. 2:1 용액을 100% HMDS로 20분 동안 교체하십시오.
      참고: HMDS는 인화성 및 급성 독소(진피 경로)입니다. HMDS는 장갑, 실험실 코트 및 눈 보호 등 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 화학 연기 후드로 처리해야합니다.
    2. 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 있는 경우 HMDS에서 샘플을 일회용 알루미늄 계량 접시로 옮킨다. 알루미늄 계량 접시에 들어가면 100% HMDS를 시료를 덮을 수 있는 신선한 100% HMDS로 교체하십시오.
    3. 시료를 신선한 건조제(5-6cm 깊이)로 플라스틱 또는 유리 비진공 건조기로 옮기고 화학 연기 후드에 넣습니다. 또는, 샘플에 이물질이 떨어지는 것을 방지하기 위해 상자와 같은 느슨한 뚜껑으로 건조화학 연기 후드에 직접 샘플을 배치합니다. 샘플을 12~24시간 동안 건조시키십시오.

4. 마운팅

  1. 드로소필라 멜라노가스터 산 (과일 파리).
    1. 알루미늄 장착 스텁의 바닥에 레이블을 지정하여 위에 배치되는 것을 나타냅니다.
      건조된 파리를 정밀 핀셋으로 해부하는 현미경 으로 스텁 상단에 고정된 접착제 또는 탄소 접착제 탭에 원하는 위치에 놓습니다.
    2. 은 전도성 접착제, 실버 페인트를 스텁의 바깥쪽 가장자리 주위에 적용하십시오. 전도도를 보장하기 위해 이쑤시개를 사용하여 실버 페인트를 파리에 연결합니다. 페인트가 원하는 이미징 영역에 닿지 않도록 하십시오.
    3. 스텁 홀더 상자에 스텁을 놓고 열린 스텁 홀더 박스를 건조기안에 놓습니다. 실버 페인트가 최소 3시간 또는 하룻밤 사이에 건조하여 최상의 결과를 얻을 수 있습니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
aluminum weighing dish Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hitachi 3400N-II SEM Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/ The company doesn't appear to sell this model any longer

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