Indlejring voksendrosophila hoveder i paraffin: Forberedelse væv til histologi

Overview

Denne video beskriver, hvordan man integrerer Drosophila hoveder i paraffin ved hjælp af krave metode, en teknik, der forbereder flyve hoveder til seriel sektionsopderinger. Paraffinsektioner bruges til histologiske undersøgelser af hjernens anatomi og til vurdering af neurodegeneration. Den fremhævede protokol viser, hvordan flere fluer kan behandles i et præparat, hvilket øger tidseffektiviteten og minimerer eksperimentelle artefakter.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Sunderhaus og Kretzschmar, Mass Histology at kvantificere Neurodegeneration i Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. Fastsættelse af hovedet på kraver og indlejring i Paraffin

BEMÆRK: Alle trin i fikseringsprocessen skal udføres i en røghætte. Methylbenzoat, mens der ikke udgør en sundhedsrisiko, har en meget tydelig lugt, som kan være overvældende, hvis ikke håndteres i en røghætte.

1. Før fluerne bedøves, fyldes 50 ml Carnoy-opløsning ved at tilsætte 15 ml kloroform og 5 ml istidseddike til 30 ml 99% ethanol (bland ikke kloroform og eddikesyre). Hæld det i en glasbeholder med en flad bund, såsom en krystalliserende skål, for at sikre, at kraverne kan lægge sig fladt og er helt dækket af opløsningen.
2. Bedøve fluerne med CO₂ eller æter.
3. Trådfluer (op til 20 med de fleste kraver) ved deres halse ind i kraverne ved hjælp af pincet. Husk at justere alle hovederne i samme retning, som det ses i figur 1A, og vær forsigtig for at sikre, at der ikke sker nogen skade på hovedet eller øjnene.
4. Medtag sine oculis fluer (pile, figur 1A) i tilfældige positioner, så fluernes rækkefølge let kan identificeres i sektionerne. Hertil kommer, at hvis de eksperimentelle fluer har en lys eller hvid øjenfarve, tråd nogle røde øjne fluer, såsom vilde type, mellem dem for at sikre, at tilstrækkelig pigment er til stede for at plette diaset. Registrer rækkefølgen af fluerne på et protokolark sammen med kravenummeret, hvis du bruger mere end en krave.
5. Når en krave er færdig, skal du placere den i den forberedte Carnoy-opløsning i 3,5 - 4 timer.
6. Dump Carnoy-opløsningen ud i den passende bortskaffelsesbeholder, og begynd ethanolvasken. Sørg for at hælde langsomt for ikke at forstyrre placeringen af kraverne i beholderen.
7. Vask kraverne i 30 minutter i 99% ethanol to gange.
8. Vask kraverne i 100% ethanol i 1 time. Sørg for at ændre vaskene til tiden for at forhindre overdehydrering.
9. Sæt kraverne i methylbenzoat O/N ved RT. Forsegl beholderen med parafilm for at forhindre fordampning af methylbenzoatet.
10. Hæld methylbenozatet i den rigtige engangsbeholder i røghætten. Der tilsættes en tidligere tilberedt blanding af 1:1 lavt smeltepunkt (56 - 57 °C) paraffin og methylbenzoat. Fra dette tidspunkt skal kraverne opbevares i en inkubator ved 65 °C for at sikre, at paraffinen ikke hærder.
11. Methylbenozat- og paraffinblandingen hældes i den rigtige engangsbeholder, og der hældes smeltet ren paraffinvoks, der holdes ved 65 °C, på kraverne.
12. Skift paraffin efter 30 min og gentag dette mindst 5 gange. Mindst 6 - 8 vaske skal udføres.
13. Når vaskene er færdige, skal du placere kraverne i en gummi isterning bakke med slots omtrent på størrelse med kraver. Hæld smeltet paraffin over dem, indtil helt dækket og lad det hærde O / N (prøv at undgå luftbobler).
14. Fjern paraffinblokkene, der indeholder kraverne, fra isterningebakken. Adskil paraffinblokken fra kraven ved hjælp af et barberblad, og afbryd forsigtigt kraven. Hovederne vil være i paraffinblokken, mens ligene forbliver i kraven. Blokkene kan opbevares ved stuetemperatur.
15. For at rengøre kraverne skal du suge dem i et deparaffineringsmiddel ved 65 °C for at fjerne paraffinen, rengøre med let skrubbe og vaske i ethanol, før de genbruges.

Representative Results

Figur 1: Seriel paraffinsektioner. A) Ved hjælp af kravemetoden kan eksperimentelle og kontrolfluer behandles som en prøve ved at gevind dem på en krave. Eyeless sine oculis fluer indsættes til orientering (pile). B) Skematisk, der viser retningen af fluehovederne i kraven. C) I dette billede er sektioner fra forskellige fluehoveder orienteret fra venstre mod højre på diaset. Fra top til bund på diaset kan serielle sektioner fra samme fluehoved ses. I dette tilfælde blev en sinus oculis flyve indsat på position tre (pil). Sektionerne er plettet af det fluorescerende øjenpigment, der skyller over sektionerne efter skæring. Skalabjælke i A = 5 mm og i C = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee.
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made-to-fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific Company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65 °C waterbath