Einbetten von erwachsenen Drosophila-Köpfen in Paraffin: Gewebe für die Histologie vorbereiten

Overview

Dieses Video beschreibt, wie Man Drosophila Köpfe in Paraffin mit der Kragenmethode einbettet, einer Technik, die Fliegenköpfe für serielle Schnitte vorbereitet. Paraffinabschnitte werden für histologische Untersuchungen der Anatomie des Gehirns und zur Beurteilung der Neurodegeneration verwendet. Das vorgestellte Protokoll zeigt, wie mehrere Fliegen in einer Zubereitung verarbeitet werden können, wodurch die Zeiteffizienz erhöht und experimentelle Artefakte minimiert werden.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Sunderhaus und Kretzschmar, Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. Fixieren des Kopfes auf Kragen und Einbettung in Paraffin

HINWEIS: Alle Schritte im Fixierungsprozess sollten in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden. Methylbenzoat stellt zwar kein Gesundheitsrisiko dar, hat aber einen sehr ausgeprägten Geruch, der überwältigend sein kann, wenn es nicht in einer Dunstabzugshaube behandelt wird.

1. Vor der Anästhesisierung der Fliegen 50 ml Carnoy-Lösung bilden, indem 15 ml Chloroform und 5 ml Eisessigsäure zu 30 ml 99% Ethanol hinzugefügt werden (die Chloroform und Essigsäure nicht mischen). Gießen Sie es in einen Glasbehälter mit einem flachen Boden, wie eine kristallisierende Schale, um sicherzustellen, dass die Kragen flach liegen können und vollständig von der Lösung abgedeckt sind.
2. Anästhetisieren Sie die Fliegen mit_CO2 oder Äther.
3. Fadenfliegen (bis zu 20 mit den meisten Kragen) am Hals in die Kragen mit Zangen. Denken Sie daran, alle Köpfe in der gleichen Ausrichtung auszurichten, wie in Abbildung 1Azu sehen, und seien Sie sanft, um sicherzustellen, dass keine Schäden am Kopf oder an den Augen auftreten.
4. Schließen Sie sine oculis Fliegen (Pfeile, Abbildung 1A) an zufälligen Positionen ein, so dass die Reihenfolge der Fliegen leicht in den Abschnitten identifiziert werden kann. Darüber hinaus, wenn die experimentellen Fliegen eine helle oder weiße Augenfarbe haben, fädeln einige rotäugige Fliegen, wie Wildtyp, zwischen ihnen, um sicherzustellen, dass genügend Pigment vorhanden ist, um das Dia zu färben. Zeichnen Sie die Reihenfolge der Fliegen auf einem Protokollblatt zusammen mit der Kragennummer auf, wenn Sie mehr als einen Kragen verwenden.
5. Sobald ein Kragen fertig ist, legen Sie ihn in die vorbereitete Carnoy-Lösung für 3,5 - 4 h.
6. Dump die Carnoy-Lösung in den entsprechenden Entsorgungskanister und beginne die Ethanol-Wasse. Achten Sie darauf, langsam zu gießen, um die Platzierung der Halsbänder im Behälter nicht zu stören.
7. Waschen Sie die Kragen für 30 min in 99% Ethanol zweimal.
8. Waschen Sie die Kragen in 100% Ethanol für 1 h. Achten Sie darauf, die Wässen rechtzeitig zu ändern, um eine Überdehydrierung zu verhindern.
9. Legen Sie die Halsbänder in Methylbenzoat O/N bei RT. Versiegeln Sie den Behälter mit Parafilm, um die Verdunstung des Methylbenzoats zu verhindern.
10. Gießen Sie das Methylbenozat in den richtigen Einwegbehälter in der Dunstabzugshaube. Fügen Sie eine zuvor hergestellte Mischung aus 1:1 niedrigem Schmelzpunkt (56 - 57 °C) Paraffinwachs und Methylbenzoat hinzu. Ab diesem Zeitpunkt müssen die Halsbänder in einem Inkubator bei 65 °C aufbewahrt werden, um sicherzustellen, dass das Paraffin nicht aushärtet.
11. Die Methylbenozate- und Paraffinmischung in den richtigen Einwegbehälter geben und geschmolzenes reines Paraffinwachs, bei 65 °C gehalten, auf die Kragen gießen.
12. Ändern Sie das Paraffin nach 30 min und wiederholen Sie dies mindestens 5 Mal. Mindestens 6 - 8 Washes sollten durchgeführt werden.
13. Sobald die Wäsche fertig ist, legen Sie die Kragen in eine Gummi-Eiswürfelschale mit Schlitzen in etwa der Größe der Kragen. Gießen Sie geschmolzenes Paraffin über sie, bis sie vollständig bedeckt sind und lassen Sie es O/N aushärten (versuchen Sie, Luftblasen zu vermeiden).
14. Entfernen Sie die Paraffinblöcke mit den Halsbändern aus der Eiswürfelschale. Trennen Sie den Paraffinblock mit einer Rasierklinge vom Kragen und brechen Sie den Kragen sanft ab. Die Köpfe werden im Paraffinblock sein, während die Körper im Kragen bleiben. Die Blöcke können bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.
15. Um die Halsbänder zu reinigen, tränken Sie sie in einem Deparafinierungsmittel bei 65 °C, um das Paraffin zu entfernen, mit leichtem Schrubben zu reinigen und vor der Wiederverwendung in Ethanol zu waschen.

Representative Results

Abbildung 1: Paraffin-Seriellabschnitte. A) Mit der Kragenmethode können Versuchs- und Kontrollfliegen als eine Probe verarbeitet werden, indem sie auf einen Kragen einfädeln. Augenlose Sinus-Oculis-Fliegen werden zur Orientierung (Pfeile) eingesetzt. B) Schematisch, der die Ausrichtung der Fliegenköpfe im Kragen anzeigt. C) In diesem Bild sind Abschnitte von verschiedenen Flugköpfen von links nach rechts auf der Folie ausgerichtet. Von oben nach unten auf der Folie sind serielle Abschnitte vom gleichen Fliegenkopf zu sehen. In diesem Fall wurde an Position drei (Pfeil) eine Sinus-Oculis-Fliege eingesetzt. Die Abschnitte werden durch das fluoreszierende Augenpigment gefärbt, das nach dem Schneiden über die Abschnitte wärdest. Maßstabsleiste in A = 5 mm und in C = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee.
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made-to-fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific Company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65 °C waterbath