הטמעת ראשי דרוזופילה למבוגרים בפרפין: הכנת רקמות להיסטולוגיה

Overview

סרטון זה מתאר כיצד להטמיע ראשי דרוזופילה בפרפין בשיטת הצווארון, טכניקה שמכינה ראשים מעופפים לקטעים סדרתיים. קטעי פרפין משמשים לבדיקות היסטולוגיות של האנטומיה של המוח ולהערכת ניוון עצבי. הפרוטוקול המוצג מדגים כיצד ניתן לעבד זבובים מרובים בהכנה אחת, ובכך להגדיל את יעילות הזמן ולצמצם חפצים ניסיוניים.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך סנדרהאוס וקרצ'מר, היסטולוגיה המונית לכמת ניוון עצבי בדרוסופילה, J. Vis. Exp. (2016).

1. תיקון הראש על צווארונים והטבעה בפרפין

שים לב: כל השלבים בתהליך הקיבעון צריכים להיעשות בברדס אדים. מתילבנזואט, בעוד לא מהווה סיכון בריאותי, יש ריח ברור מאוד, אשר יכול להיות מכריע אם לא מטופלים במכסה המנוע אדים.

1. לפני הרדמה זבובים, לפצות 50 מ"ל של פתרון קרנוי על ידי הוספת 15 מ"ל של כלורופורם ו 5 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית ל 30 מ"ל של 99% אתנול (לא לערבב את הכלורופורם וחומצה אצטית). יוצקים אותו במיכל זכוכית עם תחתית שטוחה, כגון צלחת מתגבשת, כדי להבטיח כי הצווארונים יכולים לשכב שטוח מכוסים לחלוטין על ידי הפתרון.
2. המרדים את הזבובים עם CO₂ או אתר.
3. זבובי חוט (עד 20 עם רוב הקולרים) בצווארם לתוך הקולרים באמצעות מלקחיים. זכרו ליישר את כל הראשים באותו כיוון, כפי שניתן לראות באיור 1A, והיו עדינים כדי לוודא שלא נגרם נזק לראש או לעיניים.
4. כלול זבובי סינוס אוקוליס (חצים, איור 1A)במיקומים אקראיים כך שניתן יהיה לזהות בקלות את סדר הזבובים במקטעים. בנוסף, אם לזבובים הניסיוניים יש צבע עיניים בהיר או לבן, יש להשחיל כמה זבובים אדומי עיניים, כגון טיפוס פראי, ביניהם כדי להבטיח שיש מספיק פיגמנט כדי להכתים את המגלשה. רשום את סדר הזבובים בדף פרוטוקול יחד עם מספר הצווארון אם אתה משתמש ביותר מצוויר אחד.
5. לאחר סיום הצווארון, הניחו אותו בתמיסת Carnoy המוכנה למשך 3.5 - 4 שעות.
6. לזרוק את הפתרון Carnoy לתוך מיכל סילוק המתאים ולהתחיל לשטוף אתנול. הקפד לשפוך לאט כדי לא להפריע את המיקום של הקולרים במיכל.
7. לשטוף את הצווארונים במשך 30 דקות ב 99% אתנול פעמיים.
8. לשטוף את הקולרים ב 100% אתנול במשך 1 שעות. הקפד לשנות את הכביסה בזמן כדי למנוע overdehydration.
9. שים את הקולרים במתילבנזאט O /N ב RT. לאטום את המיכל עם parafilm כדי למנוע את האידוי של מתילבנזאט.
10. יוצקים את המתילבנוזאט לתוך המיכל החד פעמי הנכון במכסה המנוע. הוסף תערובת שהוכנה בעבר של 1:1 נקודת התכה נמוכה (56 - 57 מעלות צלזיוס) שעווה פרפין ומתילבנזואט. מנקודה זו ואילך, הצווארונים צריכים להישמר באינקובטור ב 65 מעלות צלזיוס כדי לוודא כי הפרפין אינו מתקשה.
11. יוצקים את תערובת המתילבנוזאט והפרפין לתוך המיכל החד פעמי הנכון, ויוצקים שעוות פרפין טהורה מותכת, המוחזקת ב 65 מעלות צלזיוס, על הקולרים.
12. לשנות את הפרפין לאחר 30 דקות ולחזור על זה לפחות 5 פעמים. יש לבצע לפחות 6 - 8 שטיפות.
13. לאחר הכביסה הושלמה, מניחים את הקולרים לתוך מגש קוביית קרח גומי עם חריצים בערך בגודל של הצווארונים. יוצקים עליהם פרפין מותך עד שהוא מכוסה לחלוטין ומאפשרים לו להקשיח את O/N (נסו להימנע מבועות אוויר).
14. מוציאים את קוביות הפרפין המכילות את הקולרים ממגש קוביות הקרח. הפרד את בלוק הפרפין מהצווארון באמצעות סכין גילוח, ושבר בעדינות את הצווארון. הראשים יהיו בבלוק הפרפין בזמן שהגופות יישארו בצווארון. ניתן לשמור את הבלוקים בטמפרטורת החדר.
15. כדי לנקות את הקולרים, להשרות אותם סוכן deparafinization ב 65 מעלות צלזיוס כדי להסיר את הפרפין, לנקות עם קרצוף קל, ולשטוף אתנול לפני שימוש חוזר.

Representative Results

איור 1: מקטעים טוריים של פרפין. א) באמצעות שיטת הצווארון, זבובים ניסיוניים ובקרה יכולים להיות מעובדים כדוגמה אחת על ידי השחלתם על צווארון אחד. זבובים סינוס oculis ללא עיניים מוכנסים עבור כיוון (חצים). ב) סכמטי המציג את כיוון ראשי הזבוב בצווארון. ג) בתמונה זו, מקטעים מראשי זבובים שונים מכוונים משמאל לימין בשקופית. מלמעלה למטה בשקופית, ניתן לראות מקטעים טוריים מאותו ראש מעופף. במקרה זה, זבוב סינוס oculis הוכנס במיקום שלוש (חץ). החלקים מוכתמים על ידי פיגמנט העין הפלואורסצנטית השוטף את החלקים לאחר החיתוך. סרגל קנה מידה ב- A = 5 מ"מ וב- C = 0.5 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee.
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made-to-fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific Company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65 °C waterbath