Overview
इस वीडियो में बताया गया है कि कॉलर मेथड का उपयोग करके पैराफिन में ड्रोसोफिला सिर को कैसे एम्बेड किया जाए, एक तकनीक जो सीरियल सेक्शनिंग के लिए फ्लाई हेड तैयार करती है। पैराफिन वर्गों का उपयोग मस्तिष्क की शरीर रचना विज्ञान की हिस्टोलॉजिकल परीक्षाओं और न्यूरोडिजेनरेशन के मूल्यांकन के लिए किया जाता है। विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एक तैयारी में कई मक्खियों को कैसे संसाधित किया जा सकता है, जिससे समय-दक्षता में वृद्धि होती है और प्रयोगात्मक कलाकृतियों को कम किया जा सकता है।
Protocol
यह प्रोटोकॉल सुंदरहॉस और क्रेट्ज़श्मार, मास हिसटोलॉजी से ड्रोसोफिला, जे विस एक्सप्रेसमें न्यूरोडिजेनरेशन की मात्रा निर्धारित करने का एक अंश है । (2016).
1. कॉलर पर सिर फिक्सिंग और पैराफिन में एम्बेडिंग
नोट: निर्धारण प्रक्रिया में सभी चरण धूम हुड में किए जाने चाहिए। मिथाइलबेंजोएट, जबकि स्वास्थ्य जोखिम प्रस्तुत नहीं करता है, एक अत्यधिक अलग गंध होती है, जो धूम हुड में नहीं संभाली गई तो भारी हो सकती है।
- मक्खियों को एनेस्थेटाइज करने से पहले, क्लोरोफॉर्म के 15 एमएल और हिमनदों एसिटिक एसिड के 5 एमएल को 99% इथेनॉल (क्लोरोफॉर्म और एसिटिक एसिड को न मिलाएं) जोड़कर 50 एमएल कार्नॉय सॉल्यूशन बनाएं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कॉलर फ्लैट रख सकते हैं और पूरी तरह से समाधान द्वारा कवर किए जाते हैं, एक फ्लैट नीचे के साथ एक ग्लास कंटेनर में डालें, जैसे कि एक क्रिस्टलीय पकवान।
- सीओ2 या ईथर के साथ मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें।
- थ्रेड मक्खियों (अधिकांश कॉलर के साथ 20 तक) उनकी गर्दन द्वारा संदंश का उपयोग करके कॉलर में। एक ही अभिविन्यास में सभी सिरों को संरेखित करना याद रखें, जैसा कि चित्रा 1एमें देखा गया है, और यह सुनिश्चित करने के लिए कोमल रहें कि सिर या आंखों को कोई नुकसान न हो।
- यादृच्छिक स्थितियों में साइन ओक्यूलिस मक्खियों (तीर, चित्रा 1ए)को शामिल करें ताकि मक्खियों के क्रम को आसानी से वर्गों में पहचाना जा सके। इसके अलावा, यदि प्रयोगात्मक मक्खियों में हल्के या सफेद आंखों का रंग होता है, तो कुछ लाल आंखों वाली मक्खियों जैसे जंगली प्रकार को धागा करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि स्लाइड को दाग देने के लिए पर्याप्त वर्णक मौजूद है। एक से अधिक कॉलर का उपयोग करने पर कॉलर नंबर के साथ एक प्रोटोकॉल शीट पर मक्खियों के आदेश को रिकॉर्ड करें।
- एक बार कॉलर समाप्त हो जाने के बाद, इसे 3.5 - 4 घंटे के लिए तैयार कार्नॉय समाधान में रखें।
- उचित निपटान कनस्तर में Carnoy समाधान बाहर डंप और इथेनॉल धोता शुरू करते हैं। धीरे-धीरे डालना सुनिश्चित करें ताकि कंटेनर में कॉलर के प्लेसमेंट को परेशान न किया जा सके।
- 99% इथेनॉल में 30 मिनट के लिए कॉलर को दो बार धोएं।
- 1 घंटे के लिए 100% इथेनॉल में कॉलर धोएं। अतिशिक्षा को रोकने के लिए समय पर वॉश बदलना सुनिश्चित करें।
- कॉलर को मिथाइलबेंजोएट ओ/एन में आरटी में रखें । मिथाइलबेंजिएट के वाष्पीकरण को रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ कंटेनर को सील करें ।
- धुएं हुड में उचित डिस्पोजेबल कंटेनर में मिथाइलबेनोज़ेट डालो। 1:1 कम पिघलने बिंदु (56 - 57 डिग्री सेल्सियस) पैराफिन मोम और मिथाइलबेंजोएट का पहले से तैयार मिश्रण जोड़ें। इस बिंदु से, कॉलर को 65 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखने की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पैराफिन कठोर न हो।
- उचित डिस्पोजेबल कंटेनर में मिथाइलबेनोज़ेट और पैराफिन मिश्रण डालें, और कॉलर पर 65 डिग्री सेल्सियस पर रखे गए पिघले हुए शुद्ध पैराफिन मोम डालें।
- पैराफिन को 30 मिनट के बाद बदलें और इसे कम से कम 5 बार दोहराएं। कम से कम 6 - 8 वॉश किए जाने चाहिए।
- एक बार वॉश पूरा हो जाने के बाद, कॉलर को कॉलर के आकार के स्लॉट के साथ रबर आइस क्यूब ट्रे में रखें। पूरी तरह से कवर जब तक उन पर पिघला हुआ पैराफिन डालो और यह O/N कठोर करने के लिए अनुमति देते है (हवा बुलबुले से बचने की कोशिश) ।
- आइस क्यूब ट्रे से कॉलर युक्त पैराफिन ब्लॉक निकालें। एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके कॉलर से पैराफिन ब्लॉक को अलग करें, धीरे-धीरे कॉलर को तोड़ें। सिर पैराफिन ब्लॉक में होगा जबकि शव कॉलर में रहेंगे। ब्लॉक कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है।
- कॉलर को साफ करने के लिए, पैराफिनिन को हटाने, लाइट स्क्रबिंग से साफ करने और पुन: इस् तेमी से पहले इथेनॉल में धोने के लिए उन्हें 65 डिग्री सेल्सियस पर एक डेपरिफिनाइजेशन एजेंट में भिगो दें।
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Representative Results
चित्रा 1: पैराफिन सीरियल सेक्शन। ए) कॉलर विधि का उपयोग करके, प्रयोगात्मक और नियंत्रण मक्खियों को एक कॉलर पर थ्रेडिंग करके एक नमूने के रूप में संसाधित किया जा सकता है। ओरिएंटेशन (तीर) के लिए आईलेस साइन ऑक्यूलिस मक्खियों को डाला जाता है। ख) योजनाबद्ध कॉलर में फ्लाई हेड्स का ओरिएंटेशन दिखा रहा है । ग) इस छवि में, विभिन्न फ्लाई हेड्स से अनुभाग स्लाइड पर बाएं से दाएं उन्मुख होते हैं। स्लाइड पर ऊपर से नीचे तक, एक ही फ्लाई हेड से सीरियल सेक्शन देखे जा सकते हैं। इस मामले में, एक साइन ऑक्यूलिस फ्लाई को तीन (तीर) की स्थिति में डाला गया था। खंडों को फ्लोरोसेंट आई पिगमेंट से दाग दिया जाता है जो काटने के बाद वर्गों पर धोता है। एक = 5 मिमी में स्केल बार और सी = 0.5 मिमी में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collar | Genesee Scientific | TS 48-100 | We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. |
| Rubber ice cube tray for embedding | Household store | The size can be made-to-fit by glueing in additional walls | |
| Crystallizing dish | Fisher Scientific Company | 08-762-3 | |
| Ether | Fisher Scientific Company | E138-1 | |
| Ethanol | Decon Laboratories Inc. | 2701 | |
| Choloroform | Fisher Scientific Company | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific Company | A38-212 | |
| Methylbenzoate | Fisher Scientific Company | M205-500 | Distinct Odor - Use in fume hood! |
| Low Melting Point Paraffin Wax | Fisher Scientific Company | T565 | Make sure to keep extra melted in a 65 °C waterbath |
