パラフィンに成体ショ ウジョウバエ の頭部を埋め込む:組織組織の組織の準備

Overview

このビデオでは、襟法を使用してパラフィンに ショウジョウバエ ヘッドを埋め込む方法について説明します, シリアル断面のためのフライヘッドを準備する技術.パラフィンセクションは、脳の解剖学の組織学的検査と神経変性の評価のために使用されます。注目のプロトコルは、複数のハエを1回の準備で処理する方法を示し、時間効率を高め、実験的なアーティファクトを最小限に抑えます。

Protocol

このプロトコルは、サンダーハウスとクレッツシュマールからの抜粋です, ショウジョウバエの神経変性を定量化する質量のヒストロジー, J. Vis. Exp.(2016).

1. 首輪の頭を固定し、パラフィンに埋め込む

注: 固定プロセスのすべてのステップは、ヒュームフードで行う必要があります。メチルベンゾエートは、健康上のリスクを引き起こす一方で、非常に明確な臭いを持ち、ヒュームフードで扱われなければ圧倒的な場合があります。

1. ハエを麻酔する前に、カルノイ溶液の50mLを、クロロホルム15mL、氷酢酸5mLを30mLの99%エタノールに加えて(クロロホルムと酢酸を混ぜないで)結晶化皿などの平らな底を持つガラス容器に注ぎ、首輪が平らに置かれるようにし、溶液で完全に覆われていることを確認します。
2. CO2またはエーテルでハエを麻酔します。
3. 糸は鉗子を使用して首に首で(ほとんどの首輪で20まで)飛ぶ。 図 1Aに示すように、すべてのヘッドを同じ向きに揃え、頭や目に損傷が発生しないように、優しくしてください。
4. 目の飛ぶの順序をセクションで容易に識別できるように、ランダムな位置に 、目新のオクレハ エ(矢印、 図1A)を含めます。さらに、実験ハエが光または白い目の色を有する場合は、それらの間にいくつかの赤目のハエ、例えば野生のタイプをスレッドし、スライドを汚すために十分な顔料が存在することを確認する。複数の首輪を使用する場合は、プロトコルシート上のハエの順序を首輪番号と一緒に記録します。
5. 襟が完成したら、3.5〜 4時間の準備されたCarnoyソリューションに入れてください。
6. 適切な処分キャニスターにカルノイ溶液をダンプし、エタノールの洗水を開始します。コンテナ内の襟の配置を乱さないようにゆっくりと注ぐようにしてください。
7. 99%エタノールで30分間首輪を2回洗います。
8. 100%エタノールで1時間洗浄します。過脱水を防ぐために、時間通りにすすを変更してください。
9. 首輪をメチルベンゾエートO/Nに入れて、パラフィルムで容器を密封してメチルベンゾエートの蒸発を防ぎます。
10. フュームフードの適切な使い捨て容器にメチルベノザテを注ぎます。前に調製した1:1の低融点(56~57°C)パラフィンワックスとメチルベンゾアートの混合物を加えます。この時点から、パラフィンが硬化しないように、首輪を65°Cのインキュベーターに保管する必要があります。
11. 適切な使い捨て容器にメチルベノザートとパラフィン混合物を注ぎ、65°Cで保持し、襟に溶融純粋なパラフィンワックスを注ぎます。
12. パラフィンを30分後に交換し、これを5回以上繰り返します。少なくとも6〜8回の打ち込みが行われるべきである。
13. 一度、その後、襟のサイズに近いスロットを持つゴム製のアイスキューブトレイに襟を置きます。完全に覆われるまで溶融パラフィンを注ぎ、O / Nを硬化させます(気泡を避けるようにしてください)。
14. アイスキューブトレイから首輪を含むパラフィンブロックを取り外します。かみそりの刃を使用して、襟からパラフィンブロックを分離し、そっと襟を壊します。頭部はパラフィンブロックにあり、ボディは首輪にとどまります。ブロックは室温で保つことができる。
15. 襟を清掃するには、65°Cのデパラフィン化剤に浸してパラフィンを取り除き、軽いスクラブできれいにし、再利用する前にエタノールで洗浄します。

Representative Results

図1:パラフィンシリアルセクションA)カラー法を使用すると、実験ハエとコントロールハエを1つの襟に通すことによって1つのサンプルとして処理することができます。目のない新しいオクレハエは、向き(矢印)のために挿入されます。B)首輪のフライヘッドの向きを示す回路図。C)この画像では、異なるフライヘッドからのセクションは、スライド上の左から右に向いています。スライド上の上から下へ、同じフライヘッドからのシリアルセクションが見える。この場合、位置3(矢印)に、右のオキュリスフライが挿入されました。切片は切断後に切片にくる蛍光眼色素によって染色される。A = 5 mm のスケール バーと C = 0.5 mm の縮尺バーをクリックして、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee.
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made-to-fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific Company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65 °C waterbath