Incorporando cabeças de drosophila adultas em parafina: preparando tecido para histologia

Overview

Este vídeo descreve como incorporar cabeças de Drosophila em parafina usando o método de colarinho, uma técnica que prepara cabeças de mosca para seção serial. As seções de parafina são usadas para exames histológicos da anatomia do cérebro e para a avaliação da neurodegeneração. O protocolo em destaque demonstra como várias moscas podem ser processadas em uma preparação, aumentando assim a eficiência do tempo e minimizando artefatos experimentais.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Sunderhaus e Kretzschmar, Histologia em Massa para Quantificar a Neurodegeneração em Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. Fixação da Cabeça em Colares e Incorporação em Parafina

NOTA: Todas as etapas do processo de fixação devem ser feitas em um capô de fumaça. O metilbenzoato, embora não represente um risco para a saúde, tem um odor altamente distinto, que pode ser esmagador se não manuseado em um capuz de fumaça.

1. Antes de anestesiar as moscas, compõem 50 mL de solução Carnoy adicionando 15 mL de clorofórmio e 5 mL de ácido acético glacial a 30 mL de 99% de etanol (não misture o clorofórmio e o ácido acético). Despeje-o em um recipiente de vidro com um fundo plano, como um prato cristalizado, para garantir que as coleiras possam ficar planas e estiverem completamente cobertas pela solução.
2. Anestesiar as moscas com CO₂ ou éter.
3. A linha voa (até 20 com a maioria das coleiras) pelos pescoços para as coleiras usando fórceps. Lembre-se de alinhar todas as cabeças na mesma orientação, como visto na Figura 1A, e ser gentil para garantir que não ocorra nenhum dano à cabeça ou aos olhos.
4. Inclua moscas senoculis (setas, Figura 1A) em posições aleatórias para que a ordem das moscas possa ser facilmente identificada nas seções. Além disso, se as moscas experimentais tiverem uma cor de olho leve ou branco, enfie algumas moscas de olhos vermelhos, como o tipo selvagem, entre elas para garantir que o pigmento suficiente esteja presente para manchar o escorregador. Registo a ordem das moscas em uma folha de protocolo juntamente com o número da coleira se usar mais de uma coleira.
5. Uma vez que uma coleira tenha sido concluída, coloque-a na solução Carnoy preparada para 3,5 - 4 h.
6. Despeje a solução Carnoy no recipiente de descarte apropriado e inicie as lavagens de etanol. Certifique-se de derramar lentamente para não perturbar a colocação das coleiras no recipiente.
7. Lave as coleiras por 30 minutos em 99% de etanol duas vezes.
8. Lave as coleiras em 100% etanol por 1h. Certifique-se de trocar as lavagens a tempo para evitar a superdegentração.
9. Coloque as coleiras em metilbenzoato O/N na RT. Sele o recipiente com parafilme para evitar a evaporação do metilbenzoato.
10. Despeje o metilbenozado no recipiente descartável adequado no capô da fumaça. Adicione uma mistura previamente preparada de 1:1 ponto de fusão baixo (56 - 57 °C) cera de parafina e metilbenzoato. A partir deste ponto, as coleiras precisam ser mantidas em uma incubadora a 65 °C para garantir que a parafina não endureça.
11. Despeje a mistura de metilbenozato e parafina no recipiente descartável adequado, e despeje cera de parafina pura derretida, mantida a 65 °C, sobre as coleiras.
12. Mude a parafina depois de 30 minutos e repita isso pelo menos 5 vezes. Pelo menos 6 a 8 lavagens devem ser realizadas.
13. Uma vez que as lavagens estejam completas, coloque as coleiras em uma bandeja de cubos de gelo de borracha com ranhuras aproximadamente do tamanho das coleiras. Despeje a parafina derretida sobre eles até que esteja completamente coberta e deixe endurecer O/N (tente evitar bolhas de ar).
14. Remova os blocos de parafina que contêm os colares da bandeja do cubo de gelo. Separe o bloco de parafina do colarinho usando uma lâmina de barbear, quebrando suavemente o colarinho. As cabeças estarão no bloco de parafina enquanto os corpos ficarão no colarinho. Os blocos podem ser mantidos em temperatura ambiente.
15. Para limpar as coleiras, mergulhe-as em um agente de desparafinação a 65 °C para remover a parafina, limpe com a limpeza leve e lave no etanol antes de reutilizar.

Representative Results

Figura 1: Seções de Série parafina. A) Utilizando o método da coleira, moscas experimentais e de controle podem ser processadas como uma amostra, enfiando-as em uma coleira. Moscas oculis sem olhos são inseridas para orientação (setas). B) Esquema mostrando a orientação das cabeças de mosca no colarinho. C) Nesta imagem, seções de diferentes cabeças de mosca são orientadas da esquerda para a direita no slide. De cima para baixo no slide, seções seriais da mesma cabeça de mosca podem ser vistas. Neste caso, uma mosca oculis seno foi inserida na posição três (seta). As seções são manchadas pelo pigmento ocular fluorescente que lava as seções após o corte. Barra de escala em A = 5 mm e em C = 0,5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee.
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made-to-fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific Company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65 °C waterbath