Injection de mouches drosophiles adultes : une méthode de livraison de composés ou d’étiquettes

Overview

Cette vidéo décrit comment effectuer une injection de mouches adultes vivantes et comprend un protocole d’exemple dans lequel les particules étiquetées et le bleu trypan sont injectés dans les abdomens de mouche pour apaiser la phagocytose.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Nazario-Toole et Wu, Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019).

1. Préparer les particules de fluorescéine à l’injection

1. Reconstituer 10 mg de particules bactériennes disponibles dans le commerce et tuées par la chaleur étiquetées avec de la fluorescéine (voir tableau des matériaux)à une concentration de stock de 10 mg/mL en ajoutant 990 μL stérile 1x PBS et 10 μL 50 mM d’azide de sodium. Vortex à mélanger.
   1. Diviser en aliquots à usage unique de 8 μL dans des tubes de 0,2 mL et les conserver dans une boîte sombre à 4 °C afin de minimiser la sensibilité associée à la lumière.
      REMARQUE: L’agent de conservation de l’azide de sodium est facultatif et peut être omis si les stocks de 10 mg/mL sont fabriqués avec 1 mL stérile 1x PBS, aliquoted, et stockés à -20 °C.
2. Faire une solution de 10 mL de coloration alimentaire de 5% en 1x PBS en mélangeant 500 seringues filtrées colorant vert filtré et 9,5 mL stérile 1x PBS.
3. Laver les particules avant l’injection pour éliminer l’azide de sodium. Mélanger 42 μL stérile 1x PBS et 8 μL de 10 mg/mL dans un tube de 1,7 mL. Centrifugeuse à vitesse maximale pendant 2,5 min à température ambiante.
   1. Retirer le supernatant, ajouter 50 μL 1x PBS et centrifugeuse à vitesse maximale pendant 2,5 min à température ambiante.
   2. Répétez les étapes 1.3 et 1.3.1 2x, pour un total de 3 lavages.
   3. Après le lavage final, jetez le supernatant et suspendez les particules à 1,6 mg/mL dans 50 μL de colorant alimentaire de 5 % en 1x PBS.
   4. Envelopper le tube dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière. Conserver à 4 °C, jeter après 1 semaine.

2. Préparer la station d’injection et les mouches

1. Préparer la plaquette d’injection. Pour injecter jusqu’à 4 génotypes de mouches en même temps, utilisez du ruban adhésif de laboratoire pour diviser une plaquette rectangulaire de vol de CO₂ en 4 sections. Sur le banc près du microscope, désigner les zones pour placer les flacons une fois que les mouches ont été alignées sur le coussin (un pour chaque coin de la garniture).
2. Préparer des flacons de mouches appariées selon l’âge, âgées de 4 à 7 jours, pour l’injection. Pour que chaque souche soit testée, transférer 5 mâles et 5 femelles dans un flacon frais et étiqueté d’aliments préparés pour les mouches et les conserver à 25 °C.
3. Préparer l’injecteur pneumatique (voir tableau des matériaux)en fixant l’instrument à un mode TIMED de 100 ms (courtes rafales de pression de gaz pour expulser le liquide – permettant la livraison de volumes de sous-nanolitres).
4. Préparez les diapositives au microscope. Couper des bandes de ruban électrique de 1,5 pouce, plier en boucle avec le côté adhésif à l’extérieur, et placer sur une lame de microscope étiquetée.

3. Préparer des aiguilles capillaires en verre

1. Tirer les aiguilles en verre (capillaires en verre mur fin) à l’aide d’un tire-aiguille.
   1. Tenez l’aiguille sous le microscope à l’aide d’un micromètre et brisez la pointe à l#5 d’une pince à épiler en acier inoxydable à point fin. 100 pointes de μm sont suffisantes pour percer la cuticule de la mouche tout en minimisant les blessures.
   2. Mesurer le volume de liquide qui sera injecté dans chaque mouche. Chargez l’aiguille avec la coloration stérile de nourriture de 5% dans 1x PBS et expulsez le liquide sur une goutte d’huile minérale sur un micromètre de scène de 0,01 mm.
      REMARQUE: Si la gouttelette liquide est sphérique, le volume enpicolitres est calculé comme (taille) 3/1910. Une aiguille d’un diamètre de 100 μm éjecte ~2 nL en 100 ms.

4. Injecter des mouches

1. Pipette 10 μL de particules de 1,6 mg/mL sur un petit carré de parafilm.
   1. Tirez le liquide dans l’aiguille et montez dans la buse injecteur (voir tableau des matériaux).
   2. Anesthésier les mouches avec du CO_{2 et} les aligner dans leur zone désignée sur le flypad, avec le côté ventral vers le haut et les têtes orientées vers l’avant de la garniture. Placez les flacons dans les zones correspondantes sur le banc.
   3. Injecter des mouches dans le coin supérieur de l’abdomen avec des pompes liquides de 5 100 ms (~10 nL au total).
   4. Transférer les mouches injectées sur les flacons appropriés, notez l’heure sur le flacon. Conserver à 25 °C.
2. Chargez une nouvelle aiguille avec 0,4% trypan blue solution.
3. Réglez l’injecteur pneumatique à GATED, ce qui permet un flux constant d’air pour pousser le liquide hors de l’aiguille.
4. Anesthésier les mouches après qu’elles se soient reposées pendant 30 minutes et injecter avec Trypan Blue jusqu’à ce que l’abdomen soit plein et distendu.
   REMARQUE: Lors de l’examen de la maturation phagosome avec des particules étiquetées avec un colorant sensible au pH, laisser les mouches se reposer pendant 1 h et ne pas injecter avec du bleu trypan avant de monter les mouches.
5. Le mont vole sur des glissières de microscope avec le ruban électrique, côté ventral vers le bas. Poussez les ailes sur le côté de la mouche et fixez-les à la bande. En outre, poussez doucement la tête dans la bande pour s’assurer que la mouche ne bougera pas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.