성인 Drosophila 파리의 주입 : 화합물 또는 라벨 배달의 방법

이 비디오는 살아있는 성인 파리의 주입을 수행하는 방법을 설명하고 표시 입자와 trypan 파란색이 phagocytosis를 분석하기 위해 플라이 복부에 주입되는 예제 프로토콜을 포함한다.

이 프로토콜은 나자리오-툴레와 우에서 발췌, 과일 비행의 세포 면역 반응을 평가, 드로소필라 멜라노가스터, 인 비보 파고시토시스 분석서를 사용하여, J. Vis. Exp. (2019).

1. 플루오레세인 입자를 주입준비

990 μL 멸균 1x PBS 와 10 μL 50 mM 나트륨 아지드를 추가하여 10 mg/mL의 재고 농도로 플루오레세인(재료표 참조)으로 표시된 10 mg의시판되는 열사이 박테리아 입자를 재구성합니다. 혼합 소용돌이.
1. 0.2mL 튜브에 일회용 8 μL 알리코크로 나누고 4°C의 어두운 상자에 저장하여 빛 관련 감도를 최소화합니다.
  참고: 나트륨 아지드 방부제는 선택 사항이며 10 mg / mL 주식이 1 mL 멸균 1 x PBS로 만들어지고 알리 인용및 -20 ° C에서 저장되면 생략 할 수 있습니다.
500 μL 주사기 여과 녹색 식품 착색 및 9.5 mL 멸균 1 x PBS를 혼합하여 1 x PBS에서 5 % 식품 착색의 10 mL 솔루션을 확인합니다.
분사 전에 입자를 세척하여 아지드 나트륨을 제거합니다. 1.7mL 튜브에 42 μL 멸균 1x PBS와 10 mg/mL의 8 μL을 혼합합니다. 실온에서 2.5 분 동안 최대 속도로 원심 분리기.
1. 상체를 제거하고 50 μL 1x PBS를 추가하고 원심분리기를 실온에서 2.5분 동안 최대 속도로 추가합니다.
2. 총 3개의 세동을 위해 1.3 및 1.3.1 2배의 단계를 반복합니다.
3. 최종 세척 후, 1x PBS에서 5% 식품 착색의 50 μL에서 상체를 버리고 입자를 1.6 mg/mL로 다시 중단합니다.
4. 빛을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 감싸십시오. 4 °C에 저장하고 1 주일 후에 폐기하십시오.

2. 사출 스테이션을 준비하고 날아갑니다.

사출 패드를 준비합니다. 최대 4개의 지형의 파리를 동시에 주입하려면 실험실 테이프를 사용하여 직사각형 CO₂ 플라이 패드를 4개의 섹션으로 나눕니다. 현미경 근처의 벤치에는 파리가 패드에 줄지어 있는 경우 유리병을 배치할 영역을 지정합니다(패드의 각 모서리에 하나).
4-7일 된 나이에 맞는 바이알을 준비하여 주사를 맞습니다. 각 균주에 대해, 5 명의 수컷과 5 명의 암컷을 준비 된 플라이 푸드의 신선하고 라벨이 붙은 유리병으로 옮기고 25 °C에서 보관하십시오.
100ms(액체를 추방하기 위한 가스 압력의 짧은 버스트) TIMED 모드로 기기를 설정하여 공압 인젝터를 준비합니다(재료표 참조).
현미경 슬라이드를 준비합니다. 전기 테이프의 1.5 인치 스트립을 잘라 접착제 측면으로 루프로 접어, 라벨 현미경 슬라이드에 배치.

3. 유리 모세관 바늘 을 준비

바늘 풀러를 사용하여 유리 바늘 (얇은 벽 유리 모세 혈관)을 당깁니다.
1. 마이크로미터로 현미경으로 바늘을 잡고 #5 미세 점 스테인레스 스틸 핀셋을 사용하여 팁을 깰. 100 μm 팁은 상처를 최소화하면서 플라이의 큐티클을 관통하기에 충분합니다.
2. 각 플라이에 주입될 액체의 부피를 측정합니다. 1x PBS에 멸균 5% 식품 착색으로 바늘을 적재하고 0.01mm 단계 마이크로미터에서 미네랄 오일 한 방울에 액체를 배출합니다.
  참고: 액체 액적이 구형인 경우 피콜리터의 부피는 (크기)3/1910으로 계산됩니다. 직경 100μm의 바늘은 100ms에서 ~2nL를 배출합니다.

4. 파리 를 주입

1.6 mg/mL 입자의 파이펫 10 μL이 작은 파라필름 사각형에 있습니다.
1. 액체를 바늘로 당기고 인젝터 노즐에 장착하십시오(재료 표참조).
2. 마취는 CO_2로 날아가서 플라이패드의 지정된 구역에 줄을 서서 복부 쪽을 위로, 머리는 패드 앞쪽을 향합니다. 벤치에 해당 영역에 바이알을 배치합니다.
3. 5, 100 ms 펌프의 액체 (~10 nL 총)로 복부의 상부 모서리에 파리를 주입하십시오.
4. 주입된 파리를 적절한 바이알로 옮기고 바이알의 시간을 기록하십시오. 25 °C에서 유지하십시오.
0.4% 트라이판 블루 솔루션으로 새 바늘을 적재합니다.
공압 인젝터를 게이트D로설정하여 공기의 일정한 흐름이 바늘에서 액체를 밀어 낼 수 있게 합니다.
30분 동안 휴식을 취한 후 파리를 마취하고 복부가 가득 차서 비하될 때까지 Trypan Blue로 주입합니다.
참고: pH 에 민감한 염료로 표시된 입자로 충고성 성숙을 검사할 때 파리가 1 시간 동안 쉬도록 허용하고 파리를 장착하기 전에 트라이팬 블루로 주입하지 마십시오.
마운트는 전기 테이프, 복부 측면 아래로 현미경 슬라이드에 날아. 날개를 날개 옆으로 밀어 테이프에 고정합니다. 또한 머리를 테이프에 부드럽게 밀어 넣어 플라이가 움직이지 않도록 합니다.

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Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.