Injeksjon av voksne Drosophila Fluer: En metode for sammensatt eller etikett levering

Overview

Denne videoen beskriver hvordan du utfører en injeksjon av levende voksne fluer og inkluderer en eksempelprotokoll der merkede partikler og trypanblå injiseres i flueliv for å analyse fagocytose.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Nazario-Toole og Wu, vurderer den cellulære immunresponsen til fruktfluen, Drosophila melanogaster, Ved hjelp av en In Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019).

1. Forbered fluoresceinpartikler til injeksjon

1. Rekonstituere 10 mg kommersielt tilgjengelige, varme drepte bakteriepartikler merket med fluorescein (se Materialfortegnelse) til en lagerkonsentrasjon på 10 mg/ml ved å tilsette 990 μL steril 1x PBS og 10 μL 50 mM natriumazid. Virvel å blande.
   1. Del inn i engangs 8 μL aliquots i 0,2 ml rør og oppbevar i en mørk boks ved 4 °C for å minimere lys forbundet følsomhet.
      MERK: Natriumazid konserveringsmiddel er valgfritt og kan utelates hvis 10 mg / ml lagre er laget med 1 ml steril 1x PBS, alisitert og lagret ved -20 °C.
2. Lag en 10 ml oppløsning med 5% matfarging i 1x PBS ved å blande 500 μL sprøytefiltrert grønn matfarging og 9,5 ml steril 1x PBS.
3. Vask partikler før injeksjon for å fjerne natriumazid. Bland 42 μL steril 1x PBS og 8 μL 10 mg/ml i et 1,7 ml rør. Sentrifuger med maks hastighet i 2,5 min ved romtemperatur.
   1. Fjern supernatanten, tilsett 50 μL 1x PBS, og sentrifuger ved maksimal hastighet i 2,5 min ved romtemperatur.
   2. Gjenta trinn 1.3 og 1.3.1 2x, for totalt 3 vasker.
   3. Etter den endelige vasken, kast de supernatante og re-suspendere partiklene til 1,6 mg / ml i 50 μL 5% matfarging i 1x PBS.
   4. Vikle røret i aluminiumsfolie for å beskytte mot lys. Oppbevares ved 4 °C, kastes etter 1 uke.

2. Forbered injeksjonsstasjonen og fluene

1. Klargjør injeksjonsputen. For å injisere opptil 4 genotyper av fluer samtidig, bruk laboratoriebånd for å dele en rektangulær CO₂ flypute i 4 seksjoner. På benken i nærheten av mikroskopet angir du områder for å plassere hetteglassene når fluene er stilt opp på puten (en for hvert hjørne av puten).
2. Forbered hetteglass med alderstilpassede, 4-7 dager gamle, fluer til injeksjon. For hver stamme som skal testes, overfør 5 menn og 5 kvinner til et friskt, merket hetteglass med tilberedt flymat og hold ved 25 °C.
3. Forbered den pneumatiske injektoren (se Materialtabell) ved å sette instrumentet i en 100 ms (korte utbrudd av gasstrykk for å utvise væsken – slik at leveransen av sub-nanolitervolumer) TIDSBELAGT modus.
4. Forbered mikroskopets lysbilder. Klipp 1,5-tommers strimler elektrisk tape, brett inn i en løkke med klebende side ut, og legg på en merket mikroskopsklie.

3. Forbered glass kapillær nåler

1. Trekk glassnåler (tynne veggglass kapillærer) ved hjelp av en nåltrekker.
   1. Hold nålen under mikroskopet med et mikrometer og bryt spissen ved hjelp av #5 finpunkts pinsett i rustfritt stål. 100 μm spisser er tilstrekkelig til å gjennombore flyets kutikalle mens du minimerer sår.
   2. Mål volumet av væske som skal injiseres i hver flue. Last nålen med steril 5% matfarging i 1x PBS og utvis væsken på en dråpe mineralolje på et 0,01 mm trinnmikrometer.
      MERK: Hvis væskedråpen er sfærisk, beregnes volumet i picoliters som (størrelse)³/1910. En nål med en diameter på 100 μm vil kaste ut ~ 2 nL på 100 ms.

4. Injiser fluer

1. Pipette 10 μL 1,6 mg/ml partikler på en liten firkant av parafilm.
   1. Trekk væsken inn i kanylen og monter den i injektordysen (se Materialtabell).
   2. Bedøv flyr med CO₂ og stiller dem opp i sitt utpekte område på flyflaten, med ventralsiden opp og hodene orientert mot forsiden av puten. Plasser hetteglassene i tilsvarende områder på benken.
   3. Injiser fluer i øvre hjørne av magen med 5,100 ms pumper væske (~ 10 nL totalt).
   4. Overfør de injiserte fluene til de aktuelle hetteglassene, noter tiden på hetteglasset. Oppbevars ved 25 °C.
2. Legg en ny nål med 0,4% Trypan Blue Solution.
3. Sett den pneumatiske injektoren til GATED, som gjør det mulig for en konstant luftstrøm å skyve væsken ut av nålen.
4. Bedøvet flyr etter at de har hvilt i 30 min og injisert med Trypan Blue til magen er full og distended.
   MERK: Når du undersøker fagocommodning med partikler merket med et pH-følsomt fargestoff, la fluer hvile i 1 time og ikke injiser med trypanblå før du monterer fluer.
5. Mount flyr på mikroskop lysbilder med elektrisk tape, ventral side ned. Skyv vingene til siden av flyet og fest dem til båndet. Skyv også hodet forsiktig inn i båndet for å sikre at flyet ikke beveger seg.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.