Injeção de Moscas de Drosophila Adulta: Um método de entrega de compostos ou rótulos

Overview

Este vídeo descreve como realizar uma injeção de moscas adultas vivas e inclui um protocolo de exemplo no qual partículas rotuladas e azul tripano são injetados em abdômens de mosca para avaliar a fagocitose.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Nazario-Toole e Wu, Avaliando a Resposta Imune Celular da Mosca da Fruta, Drosophila melanogaster, Utilizando um Ensaio de Fagocitose In Vivo, J. Vis. Exp. (2019).

1. Prepare partículas de fluoresceína para injeção

1. Reconstituir 10 mg de partículas de bactérias comercialmente disponíveis e mortas pelo calor rotuladas com fluoresceína (ver Tabela de Materiais) a uma concentração de estoque de 10 mg/mL adicionando 990 μL estéreis 1x PBS e 10 μL 50 mM de azida de sódio. Vórtice para misturar.
   1. Divida em alíquotas de uso único de 8 μL em tubos de 0,2 mL e armazene em uma caixa escura a 4 °C para minimizar a sensibilidade associada à luz.
      NOTA: O conservante de azida de sódio é opcional e pode ser omitido se os estoques de 10 mg/mL forem feitos com 1 mL de PBS estéril, aliquoted e armazenado a -20 °C.
2. Faça uma solução de 10 mL de coloração alimentar de 5% em 1x PBS misturando 500 μL de corante de alimentos verdes filtrados e 9,5 mL estéril 1x PBS.
3. Lave partículas antes da injeção para remover azida de sódio. Misture 42 μL estéreis 1x PBS e 8 μL de 10 mg/mL em um tubo de 1,7 mL. Centrífuga em velocidade máxima por 2,5 min a temperatura ambiente.
   1. Remova o supernasciente, adicione 50 μL 1x PBS e centrífuga em velocidade máxima por 2,5 min a temperatura ambiente.
   2. Repita as etapas 1.3 e 1.3.1 2x, para um total de 3 lavagens.
   3. Após a lavagem final, descarte as partículas supernascentes e re-suspendam as partículas para 1,6 mg/mL em 50 μL de coloração alimentar de 5% em 1x PBS.
   4. Enrole o tubo em papel alumínio para proteger da luz. Armazene a 4 °C, descarte após 1 semana.

2. Prepare a estação de injeção e voe

1. Prepare a almofada de injeção. Para injetar até 4 genótipos de moscas ao mesmo tempo, use fita de laboratório para dividir uma plataforma de mosca de CO₂ retangular em 4 seções. No banco perto do microscópio, designe áreas para colocar os frascos uma vez que as moscas foram alinhadas no bloco (um para cada canto da almofada).
2. Prepare frascos de idade combinada, 4-7 dias de idade, moscas para injeção. Para que cada cepa seja testada, transfira 5 machos e 5 fêmeas para um frasco fresco e rotulado de alimentos preparados e mantenha a 25 °C.
3. Prepare o injetor pneumático (ver Tabela de Materiais) definindo o instrumento para um modo TIMED de 100 ms (rajadas curtas de gás para expelir o líquido – permitindo a entrega de volumes sub-nanolitera) modo TIMED.
4. Prepare os slides do microscópio. Corte tiras de 1,5 polegadas de fita elétrica, dobre em um laço com o lado adesivo para fora e coloque em um slide de microscópio rotulado.

3. Prepare agulhas capilares de vidro

1. Puxe agulhas de vidro (capilares finos de vidro de parede) usando um puxador de agulha.
   1. Segure a agulha sob o microscópio com um micrômetro e quebre a ponta usando #5 pinça de aço inoxidável de ponto fino. As pontas de 100 μm são suficientes para perfurar a cutícula da mosca, minimizando o ferimento.
   2. Meça o volume de líquido que será injetado em cada mosca. Carregue a agulha com coloração alimentar estéril de 5% em 1x PBS e expulse o líquido em uma gota de óleo mineral em um micrômetro de estágio de 0,01 mm.
      NOTA: Se a gota líquida for esférica, o volume em picoliters é calculado como (tamanho)³/1910. Uma agulha com um diâmetro de 100 μm ejetará ~2 nL em 100 ms.

4. Injetar moscas

1. Pipeta 10 μL de partículas de 1,6 mg/mL em um pequeno quadrado de parafilm.
   1. Puxe o líquido para dentro da agulha e monte no bocal do injetor (ver Tabela de Materiais).
   2. Anesthetize voa com CO₂ e alinhá-los em sua área designada no flypad, com o lado ventral para cima e as cabeças orientadas para a frente da almofada. Coloque frascos em áreas correspondentes no banco.
   3. Injete moscas no canto superior do abdômen com bombas de 5,100 ms de líquido (~10 nL total).
   4. Transfira as moscas injetadas para os frascos apropriados, observe o tempo no frasco. Mantenha-se a 25 °C.
2. Carregue uma agulha nova com 0,4% trypan blue solution.
3. Ajuste o injetor pneumático para GATED,o que permite um fluxo constante de ar para empurrar o líquido para fora da agulha.
4. Anestesize voa depois de descansar por 30 minutos e injetar com Trypan Blue até que o abdômen esteja cheio e distendido.
   NOTA: Ao examinar a maturação de fagosome com partículas rotuladas com um corante sensível ao pH, deixe as moscas descansarem por 1h e não injete com azul trypan antes de montar moscas.
5. Monte voa em deslizamentos de microscópio com fita elétrica, lado ventral para baixo. Empurre as asas para o lado da mosca e fixe-as na fita. Além disso, empurre suavemente a cabeça para dentro da fita para garantir que a mosca não se mova.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.