Инъекция взрослых мух дрозофилы: метод соединения или доставки этикетки

Overview

Это видео описывает, как выполнить инъекцию живых взрослых мух и включает в себя пример протокола, в котором помеченные частицы и трипан синий вводятся в мухи брюшной полости для анализа фагоцитоза.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Назарио-Тул и Ву, Оценка клеточной иммунной реакции плодовой мухи, Drosophila меланогастер, Использование In Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019).

1. Подготовка частиц флуорессейна для инъекций

1. Восстановить 10 мг коммерчески доступных, тепло-убитых частиц бактерий помечены флуорессейном (см. Таблица материалов) к концентрации запасов 10 мг/мл, добавив 990 йл стерильных 1x PBS и 10 йл 50 мМ натрия азида. Вихрь смешивать.
   1. Разделите на одноразовые 8 йл алициты в трубках 0,2 мл и храните в темной коробке при 4 градусах Цельсия, чтобы свести к минимуму чувствительность, связанную со светом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Консервант азида натрия является необязательным и может быть опущен, если 10 мг/мл запасов сделаны с 1 мл стерильных 1x PBS, aliquoted, и хранятся при -20 градусов по Цельсию.
2. Сделайте 10 мл раствор 5% пищевой краситель в 1x PBS путем смешивания 500 L шприц фильтруется зеленый пищевой краситель и 9,5 мл стерильных 1x PBS.
3. Вымойте частицы перед инъекцией, чтобы удалить азид натрия. Смешайте 42 Л стерильных 1x PBS и 8 л 10 мг/мл в 1,7 мл трубки. Центрифуга на максимальной скорости в течение 2,5 мин при комнатной температуре.
   1. Удалите супернатант, добавьте 50 МКЛ 1x PBS и центрифугу с максимальной скоростью в течение 2,5 мин при комнатной температуре.
   2. Повторите шаги 1.3 и 1.3.1 2x, в общей сложности 3 моет.
   3. После окончательной стирки отбросьте супернатант и повторно приостановьте частицы до 1,6 мг/мл в 50 л 5% пищевой краситель в 1x PBS.
   4. Оберните трубку в алюминиевую фольгу, чтобы защитить от света. Хранить при 4 градусов по Цельсию, отбросить через 1 неделю.

2. Подготовье инъекционной станции и мух

1. Подготовь прокладку для инъекций. Для одновременного введения до 4 генотипов мух используйте лабораторную ленту, чтобы разделить прямоугольную площадку для полетов CO₂ на 4 секции. На скамейке возле микроскопа, назначить области для места флаконы раз мухи были выстроены на площадку (по одному для каждого угла площадки).
2. Подготовка флаконов возрастных, 4-7 дней, мух для инъекций. Для каждого штамма, который будет протестирован, перенесите 5 самцов и 5 самок в свежий, помеченный флакон приготовленной пищи мухи и держите при 25 градусов по Цельсию.
3. Подготовь пневматический инжектор (см.таблицу материалов), установив прибор на 100 мс (короткие всплески давления газа, чтобы изгнать жидкость , что позволяет доставку суб-нанолитров объемов) TIMED режиме.
4. Подготовь слайды микроскопа. Вырезать 1,5-дюймовые полоски электрической ленты, сложить в петлю с клеем стороны, и место на помечены микроскоп слайд.

3. Подготовка стеклянных капиллярных игл

1. Потяните стеклянные иглы (тонкие стеклянные капилляры стены) с помощью иглы шкив.
   1. Держите иглу под микроскопом с микрометром и разорвать кончик с помощью тонкой #5 пинцетом из нержавеющей стали. 100 мкм советы достаточно, чтобы пробить кутикулу мухи при минимизации ран.
   2. Измерьте объем жидкости, которая будет вводиться в каждую муху. Загрузите иглу стерильной 5% пищевой краситель в 1x PBS и изгнать жидкость на каплю минерального масла на 0,01 мм стадии микрометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если жидкая капля сферическая, объем пиколитеров рассчитывается как (размер)³/1910. Игла диаметром 100 мкм будет выбрасывать 2 нл в 100 мс.

4. Инъекционные мухи

1. Pipette 10 йл частиц 1,6 мг/мл на небольшой квадрат парафильма.
   1. Потяните жидкость в иглу и смонтировать в сопло инжектора (см. Таблицу материалов).
   2. Анестезия мух с CO_{2 и выстроить} их в назначенном месте на flypad, с брюшной стороны вверх и головы, ориентированные на передней панели. Поместите флаконы в соответствующих областях на скамейке запасных.
   3. Инъекционные мухи в верхнем углу живота с 5, 100 мс насосов жидкости (всего 10 нл).
   4. Перенесите инъекционные мухи на соответствующие флаконы, обратите внимание на время на флаконе. Хранить при 25 градусов по Цельсию.
2. Загрузите новую иглу с 0,4% Trypan Blue Solution.
3. Установите пневматический инжектор на GATED, что позволяет постоянному потоку воздуха выталкивать жидкость из иглы.
4. Анестезировать мух после того, как они отдохнули в течение 30 минут и вводить с Trypan Blue до тех пор, пока живот полон и разтянут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При изучении фагосомного созревания с частицами, помеченными рН-чувствительным красителем, дайте мухам отдохнуть в течение 1 ч и не вводить трипан синий перед монтажом мух.
5. Гора летит на микроскоп слайды с электрической лентой, брюшной стороны вниз. Нажмите крылья в сторону мухи и закретить их на ленту. Кроме того, осторожно нажмите головой в ленту, чтобы убедиться, что муха не будет двигаться.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.