Inyección de moscas drosophila adultas: un método de entrega de compuestos o etiquetas

Overview

Este video describe cómo realizar una inyección de moscas adultas vivas e incluye un protocolo de ejemplo en el que las partículas etiquetadas y el azul trypan se inyectan en los abdomens de mosca para adivino fagocitosis.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Nazario-Toole y Wu, Evaluación de la Respuesta Inmune Celular de la Mosca de la Fruta, Drosophila melanogaster, Utilizando un ensayo de fagocitosis in vivo, J. Vis. Exp. (2019).

1. Preparar partículas de fluoresceína para inyección

1. Reconstituir 10 mg de partículas de bacterias muertas por calor disponibles comercialmente etiquetadas con fluoresceína (ver Tabla de Materiales)a una concentración de stock de 10 mg/ml añadiendo 990 μL estériles 1x PBS y 10 μL 50 mM azida sódica. Vórtice para mezclar.
   1. Divida en alíquesas de un solo uso de 8 μL en tubos de 0,2 ml y guárdelos en una caja oscura a 4 °C para minimizar la sensibilidad asociada a la luz.
      NOTA: El conservante de azida sódica es opcional y se puede omitir si se hacen 10 mg/ml de caldo con 1 ml estéril 1x PBS, alácuota y almacenada a -20 °C.
2. Haga una solución de 10 ml de colorante de alimentos al 5% en 1x PBS mezclando 500 μL de coloración de alimentos verdes filtrados y 9,5 ml estériles 1x PBS.
3. Lave las partículas antes de la inyección para eliminar el azide sódico. Mezclar 42 μL estéril 1x PBS y 8 μL de 10 mg/ml en un tubo de 1,7 ml. Centrífuga a velocidad máxima de 2,5 min a temperatura ambiente.
   1. Retire el sobrenadante, agregue 50 μL 1x PBS y centrífuga a una velocidad máxima de 2,5 minutos a temperatura ambiente.
   2. Repita los pasos 1.3 y 1.3.1 2x, para un total de 3 lavados.
   3. Después del lavado final, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las partículas a 1,6 mg/ml en 50 μL de coloración de alimentos al 5% en 1x PBS.
   4. Envuelva el tubo en papel de aluminio para protegerlo de la luz. Conservar a 4 °C, desechar después de 1 semana.

2. Prepare la estación de inyección y vuele

1. Prepare la almohadilla de inyección. Para inyectar hasta 4 genotipos de moscas al mismo tiempo, utilice cinta de laboratorio para dividir una almohadilla de mosca rectangular de CO₂ en 4 secciones. En el banco cerca del microscopio, designe áreas para colocar los viales una vez que las moscas hayan sido alineadas en la almohadilla (una por cada esquina de la almohadilla).
2. Prepare viales de moscas a la inyección a partir de 4-7 días de edad. Para cada cepa a probar, transfiera 5 machos y 5 hembras a un vial fresco y etiquetado de alimento para moscas preparados y manténgalo a 25 °C.
3. Prepare el inyector neumático (véase tabla de materiales)estableciendo el instrumento en un modo TIMED de 100 ms (ráfagas cortas de presión de gas para expulsar el líquido, lo que permite la entrega de volúmenes sub nanolitro).
4. Prepare las diapositivas del microscopio. Corte tiras de cinta eléctrica de 1,5 pulgadas, doble en un bucle con el lado adhesivo hacia fuera y colóquelo en un portaobjetos etiquetado.

3. Preparar agujas capilares de vidrio

1. Tire de agujas de vidrio (capilares de vidrio de pared delgada) usando un extractor de aguja.
   1. Sujete la aguja debajo del microscopio con un micrómetro y rompa la punta con #5 pinzas de acero inoxidable de punto fino. Las puntas de 100 μm son suficientes para perforar la cutícula de la mosca mientras se minimizan las heridas.
   2. Mida el volumen de líquido que se inyectará en cada mosca. Cargue la aguja con coloración estéril de alimentos al 5% en 1x PBS y expulse el líquido sobre una gota de aceite mineral en un micrómetro de etapa de 0,01 mm.
      NOTA: Si la gota líquida es esférica, el volumen en picolitros se calcula como (tamaño)³/1910. Una aguja con un diámetro de 100 μm expulsará ~2 nL en 100 ms.

4. Inyecte moscas

1. Pipeta 10 μL de partículas de 1,6 mg/ml en un pequeño cuadrado de parafilm.
   1. Tire del líquido hacia la aguja y colóquelo en la boquilla del inyector (ver Tabla de materiales).
   2. Anestesia moscas con CO₂ y alinee en su área designada en el flypad, con el lado ventral hacia arriba y las cabezas orientadas hacia la parte delantera de la almohadilla. Coloque viales en las áreas correspondientes en el banco.
   3. Inyecte moscas en la esquina superior del abdomen con bombas de 5.100 ms de líquido (~10 nL en total).
   4. Transfiera las moscas inyectadas a los viales apropiados, observe la hora en el vial. Conservar a 25 °C.
2. Cargue una aguja nueva con 0.4% Trypan Blue Solution.
3. Ajuste el inyector neumático a GATED,lo que permite un flujo constante de aire para empujar el líquido fuera de la aguja.
4. Anestesia moscas después de haber descansado durante 30 minutos e inyectarse con Trypan Blue hasta que el abdomen esté lleno y distendido.
   NOTA: Al examinar la maduración fagorosa con partículas etiquetadas con un tinte sensible al pH, permita que las moscas descansen durante 1 h y no se inyecten con tripa azul antes de montar moscas.
5. Monte las moscas en diapositivas del microscopio con cinta eléctrica, lado ventral hacia abajo. Empuje las alas hacia el lado de la mosca y fíjelas en la cinta. Además, empuje suavemente la cabeza hacia la cinta para asegurarse de que la mosca no se mueva.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.