口味偏好分析：测量嗜血杆菌喂养行为的方法

Overview

此视频描述了味觉偏好检测，这是一种行为方法，用于通过评估苍蝇在摄入首选物质后腹部着色来测量对颜色溶液的吸引力或避免程度不同。特色协议演示了用于测量苍蝇对不同蔗糖浓度解决方案的偏好的程序。

Protocol

本协议摘自班特尔和泰西尔，成人德罗索菲拉口味偏好分析，J.Vis.Exp.（2016年）。 

1. 饥饿

1. 通过在标准飞瓶底部用18.2 MΩ水饱和棉球来准备苍蝇饥饿小瓶。或者，同样，用18.2 MΩ水饱和一小块滤纸，并在小瓶内放置一个角度。
2. 将苍蝇收集到 CO₂ 垫上 100 种动物中，然后将苍蝇添加到准备好的小瓶中。
   注： 最好的结果是获得不到5天的动物。然而，动物的确切年龄可以作为实验变量来控制，以确定随着时间的不同，味道偏好的变化。
3. 使用棉球或泡沫塞固定小瓶关闭。将小瓶放在环境控制的孵化器中。将温度保持在 25 °C，湿度保持在 70% 以上。将小瓶原封不动24小时。

2. 口味偏好分析

1. 准备所有美味的检测在同一天测试。
   注： 所使用的的确切美味会因实验问题而异。以下是本协议中使用的示例美味。有关优化，请参阅第 4 节。
   1. 通过结合 10 μl 的 100 mM 蔗糖溶液、13 μl 的红色食品着色和 977 μl 的 18.2 MΩ 水，准备控制调色剂 （1 mM 蔗糖）。
   2. 通过结合 50μl 的 100 m 蔗糖溶液、10 μl 的蓝色食物着色和 940 μl 的 18.2 MΩ 水，准备实验性调色剂 （5 m M 蔗糖）。
2. 使用标准 100 mm x 15 mm 塑料培养皿制作检测室，采用以下方式准备：
   1. 在 12 点将三滴 10μl 的控制味剂放在离板边缘最近的位置，在 6 点放置另外 3 滴控制调味剂。确保掉落之间的间距相似。
   2. 在 3 点钟放置三滴 10μl 的实验性美味，在 9 点放置另外 3 滴实验性美味。确保掉落之间的间距相似。
   3. 重复步骤 2.2.1 和 2.2.2，以尽可能多地复制。
3. 空的 1 瓶约 100 饥饿苍蝇到 CO₂ 垫上足够长的时间麻醉所有动物 （约 10 秒） 。将动物刷进准备好的检测室中间，盖上盘盖。
   注： 应避免_{延长二氧化碳} 暴露期，以延长恢复时间并限制对喂养行为的干扰。暴露在冰上（约5分钟）可用于麻醉，以避免_{二氧化碳的行为} 影响，可能来自甚至有限的暴露。
4. 将检测室放在一个不透明的纸板箱中。请务必在测试条件和基因型的情况下给盒子外部贴上标签。
5. 将整个设置（从步骤 2.4 包含在纸板箱中的检测室）放入湿度至少为 70% 的 25 °C 孵化器中，2 小时。
6. 对于所有复制品，重复步骤 2.3 到 2.5。
7. 2 小时后，将仍存放在纸板箱中的检测室直接放入 -20 °C 冰柜中，直到准备好进行量化。

3. 口味偏好分析量化

1. 允许单个检测室加热到室温（约 5 分钟）。
2. 在解剖显微镜下，使用刷子或一对钳子，根据它们腹部的颜色组动物：红色、蓝色、紫色或透明（图1）。
3. 记录每个组中的动物数量。考虑明确的动物没有参与检测，因此不包括他们在任何计算。
4. 根据以下方程之一计算偏好指数：
   1. 如果将感兴趣的实验性调色剂添加到红色染料中，则使用（N_红色 + 0.5N_紫色）/（N_红色 + N_蓝色 + N_紫色）。
   2. 如果将实验性调色剂添加到蓝色染料中，则将方程调整为（N_蓝色 = 0.5N_紫色）/（N_蓝色 + N_红色 + N_紫色）。
5. 重复所有实验条件的计算并复制。

4. 口味偏好分析的优化

1. 经验确定要使用的食物着色指标的浓度，以便食品着色不影响味觉测定的结果，如下所示：
   1. 使用步骤 2.1 中指示的相同基础化合物（如 5 mM 蔗糖）准备 4 种色素，但省略了食物着色。
   2. 在其中一种调色剂中加入 1.3% 的红色食物色素。使其余3个色素与蓝色食物着色不同浓度在每个管（如 0.6%，1%，和1.3%）。
   3. 每对美味的完整协议步骤 2.2 至 3.4：1.3% 红色，0.6% 蓝色;1.3% 红色对 1% 蓝色和 1.3% 红色与 1.3% 蓝色。
   4. 重复步骤 4.1.1-4.1.3 与不同百分比的蓝色食品着色，直到偏好指数平均值为 0 （图 2）。
      注： 作为起点，1.3%的红色食品着色加上1%的蓝色食品着色通常产生良好的效果。如果蓝色食品着色浓度不能与1.3%的染料相匹配，则步骤4.1.1至4.1.3可以重复不同浓度的红色着色和不断浓度的蓝色食品着色。
   5. 分析所有需要测试的条件，以相同的优化食品着色浓度。

Representative Results

图1：口味偏好检测结果。 显示了腹部着色变化的一些示例。深红色摄入（A）。浅红色摄入（B）。深蓝色摄入（C）。浅蓝色摄入（D）。当整个颜色显示为紫色（E），或腹部的不同区域显示红色（箭头）和蓝色（箭头）（F）的单独部分时，则考虑紫色腹部。 请单击此处查看此图的更大版本。

图2：控制食物着色效果。 在调味剂中加入食物着色剂不应对动物的口味偏好产生任何影响。在保持红色染料恒定浓度的同时改变蓝色染料的浓度，可以发现 1.3% 的红色与 1.0% 蓝色的最佳组合。这由接近 0.5 的偏好指数值表示。值是标准偏差的平均值±。*p&0.05，***p&0.001从双面学生的t测试。 请单击此处查看此图的更大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160