Ensaio de preferência de sabor: um método para medir o comportamento alimentar em Drosophila

Overview

Este vídeo descreve o ensaio de preferência de sabor, um método comportamental usado para medir a atração ou evitar soluções coloridas que têm um gosto diferente, avaliando a coloração abdominal da mosca após a ingestão da substância preferida. O protocolo em destaque demonstra o procedimento utilizado para medir a preferência das moscas em soluções de diferentes concentrações de sacarose.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Bantel e Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. Fome

1. Prepare frascos de fome de mosca saturando uma bola de algodão com 18,2 MΩ de água no fundo de um frasco de mosca padrão. Alternativamente, saturar uma pequena tira de papel filtro com água de 18,2 MΩ e colocar em um ângulo dentro do frasco.
2. Colete moscas em conjuntos de ~100 animais em uma almofada de CO₂ e, em seguida, adicione as moscas a um frasco preparado.
   NOTA: Os melhores resultados são obtidos com animais com menos de 5 dias de idade. No entanto, a idade exata dos animais pode ser controlada como uma variável experimental para determinar mudanças na preferência de paladar ao longo do tempo.
3. Use uma bola de algodão ou rolha de espuma para fixar os frascos fechados. Coloque frascos do lado deles em uma incubadora ambientalmente controlada. Mantenha a temperatura a 25 °C, e a umidade acima de 70%. Deixe frascos intocados por 24 horas.

2. Ensaio de preferência de sabor

1. Prepare todos os tastants para o ensaio no mesmo dia do teste.
   NOTA: Os tastants exatos a serem usados variam dependendo da pergunta experimental que está sendo feita. A seguir, exemplos de tastants usados neste protocolo. Consulte a seção 4 para obter otimizações.
   1. Prepare o controle tastant (1 mM sacarose) combinando 10 μl de solução de sacarose de 100 mM, 13 μl de coloração de alimentos vermelhos e 977 μl de água de 18,2 MΩ.
   2. Prepare o tastant experimental (5 mM sacarose) combinando 50 μl de solução de sacarose de 100 mM, 10 μl de coloração de alimentos azuis e 940 μl de água de 18,2 MΩ.
2. Faça câmaras de ensaio usando uma placa de petri de plástico padrão de 100 mm x 15 mm preparada da seguinte maneira:
   1. Coloque três gotas de 10 μl de controle mais próximas da borda da placa às 12 horas e outras 3 gotas às 6 horas. Certifique-se de que o espaçamento entre as gotas é semelhante.
   2. Coloque três gotas de 10 μl de tastant experimental mais próximo da borda da placa às 3 horas e outras 3 gotas às 9 horas. Certifique-se de que o espaçamento entre as gotas é semelhante.
   3. Repita as etapas 2.2.1 e 2.2.2 para quantas réplicas desejarem.
3. 1 frasco vazio de ~100 moscas famintas em uma almofada de CO_{2 apenas} o tempo suficiente para anestesiar todos os animais (aproximadamente 10 segundos). Escove os animais no meio de uma câmara de ensaio preparada e cubra com a tampa do prato.
   NOTA: Períodos mais longos de exposição ao CO₂ devem ser evitados para melhorar o tempo de recuperação e limitar a interferência com o comportamento alimentar. A exposição ao gelo (~5 min) pode ser usada para anestesiar para evitar efeitos comportamentais de CO₂ que possam surgir até mesmo de exposição limitada.
4. Coloque a câmara de ensaio em uma caixa de papelão opaca. Certifique-se de rotular o lado de fora da caixa com a condição e o genótipo sendo testados.
5. Coloque toda a configuração (câmara de ensaio contida dentro da caixa de papelão a partir da etapa 2.4) em uma incubadora de 25 °C com pelo menos 70% de umidade por 2 horas.
6. Repita as etapas 2.3 a 2.5 para todas as réplicas.
7. Após 2 horas, coloque as câmaras de ensaio, ainda contidas dentro de caixas de papelão, diretamente em um congelador de -20 °C até estar pronto para a quantitação.

3. Quantificação do ensaio de preferência de sabor

1. Permita que uma única câmara de ensaio aqueça até a temperatura ambiente (aproximadamente 5 minutos).
2. Sob um microscópio de dissecção, utilizando um pincel ou par de fórceps, animais de grupo baseados na cor de seu abdômen: vermelho, azul, roxo ou claro(Figura 1).
3. Regisso o número de animais em cada agrupamento. Considere que animais claros não participaram do ensaio e, portanto, não os incluem em nenhum cálculo.
4. Calcule o índice de preferência de acordo com uma das seguintes equações:
   1. Se o tastant experimental de interesse for adicionado ao corante vermelho, use em seguida (N_vermelho + 0,5N_roxo)/(N_vermelho + N_azul + N_roxo).
   2. Se o tastante experimental for adicionado ao corante azul, ajuste a equação para (N_azul + 0,5N_roxo)/(N_azul + N_vermelho +_{N roxo}).
5. Repita os cálculos para todas as condições experimentais e réplicas.

4. Otimização do ensaio de preferência de sabor

1. Determinar empiricamente a concentração de indicadores de coloração alimentar a serem utilizados para que a coloração alimentar não afete o resultado do ensaio de sabor, como segue:
   1. Prepare 4 tastants usando o mesmo composto base (por exemplo, 5 mM de sacarose) como indicado na etapa 2.1, mas omita a coloração alimentar.
   2. Adicione 1,3% de corante de comida vermelha a um dos tastants. Faça os 3 tastants restantes com corante alimentar azul de concentrações variadas em cada tubo (por exemplo, 0,6%, 1% e 1,3%).
   3. Etapas completas do protocolo 2.2 a 3.4 para cada par tastant: 1,3% vermelho vs. 0,6% azul; 1,3% vermelho vs. 1% azul e 1,3% vermelho vs. 1,3% azul.
   4. Repetir o passo 4.1.1-4.1.3 com diferentes percentuais de coloração de alimentos azuis até que o índice de preferência seja mediano de 0 (Figura 2).
      NOTA: Como ponto de partida, 1,3% de corante de alimentos vermelhos, juntamente com 1% de corante alimentar azul normalmente rende bons resultados. Se nenhuma concentração satisfatória de corante de alimentos azuis pode ser combinada com 1,3% de corante, então o passo 4.1.1 a 4.1.3 pode ser repetido com concentrações variadas de coloração vermelha e uma concentração constante de coloração de alimentos azuis.
   5. Analise todas as condições a serem testadas com as mesmas concentrações otimizadas de coloração alimentar.

Representative Results

Figura 1: Resultados do ensaio de preferência de sabor. Alguns exemplos na variação da coloração abdominal são mostrados. Vermelho escuro ingerido(A). Vermelho-claro ingerido(B). Azul escuro ingerido(C). Azul claro ingerido(D). Os abdômens roxos são considerados quando toda a coloração aparece roxa (E), ou quando regiões distintas do abdômen mostram porções de vermelho (ponta de flecha) e partes separadas de azul (seta)(F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Controle para efeitos de coloração alimentar. A adição da coloração alimentar aos tastants não deve ter qualquer efeito na preferência de sabor dos animais. Variar a concentração de corante azul, mantendo uma concentração constante de corante vermelho revelou uma combinação ótima de 1,3% de vermelho a 1,0% azul. Isso é indicado por um valor de índice de preferência perto de 0,5. Os valores são a média ± desvio padrão. *p < 0,05, ***p < 0,001 do t-teste do aluno de dois lados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160