Ensayo de preferencias de sabor: un método para medir el comportamiento de alimentación en Drosophila

Overview

Este video describe el ensayo de preferencia de sabor, un método de comportamiento utilizado para medir la atracción o evitar soluciones de color que saben de manera diferente mediante la evaluación de la coloración abdominal de la mosca después de la ingestión de la sustancia preferida. El protocolo destacado demuestra el procedimiento utilizado para medir la preferencia de las moscas hacia soluciones de concentraciones de sacarosa variables.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Bantel y Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. Inanición

1. Prepare viales de inanición de mosca saturando una bola de algodón con agua de 18,2 MΩ en la parte inferior de un vial de mosca estándar. Alternativamente, saturar de manera similar una pequeña tira de papel filtrante con agua de 18,2 MΩ y colocar en un ángulo dentro del vial.
2. Recoger moscas en conjuntos de ~ 100 animales en una almohadilla de CO₂ y luego añadir las moscas a un vial preparado.
   NOTA: Los mejores resultados se obtienen con animales de menos de 5 días de antigüedad. Sin embargo, la edad exacta de los animales se puede controlar como una variable experimental para determinar los cambios en la preferencia del gusto con el tiempo.
3. Utilice una bola de algodón o un tapón de espuma para asegurar los viales cerrados. Coloque los viales de su lado en una incubadora controlada por el medio ambiente. Mantenga la temperatura a 25 °C y la humedad por encima del 70%. Deje los viales intactos durante 24 horas.

2. Ensayo de preferencias de sabor

1. Prepare todos los tacanes para el ensayo el mismo día que las pruebas.
   NOTA: Los tastants exactos que se utilizarán variarán dependiendo de la pregunta experimental que se esté haciendo. A continuación se presentan los tastants de ejemplo utilizados en este protocolo. Consulte la sección 4 para obtener optimizaciones.
   1. Prepare el tacstante de control (1 mM de sacarosa) combinando 10 μl de solución de sacarosa de 100 mM, 13 μl de coloración roja de alimentos y 977 μl de agua de 18,2 MΩ.
   2. Preparar tacante experimental (sacarosa de 5 mM) combinando 50 μl de solución de sacarosa de 100 mM, 10 μl de coloración de alimentos azules y 940 μl de agua de 18,2 MΩ.
2. Haga cámaras de ensayo utilizando una placa de petri de plástico estándar de 100 mm x 15 mm preparada de la siguiente manera:
   1. Coloque tres gotas de control de 10 μl más cercanas al borde de la placa a las 12 en punto y otras 3 gotas a las 6 en punto. Asegúrese de que el espaciado entre caídas sea similar.
   2. Coloque tres gotas de 10 μl de tacante experimental más cercano al borde de la placa a las 3 en punto y otras 3 gotas a las 9 en punto. Asegúrese de que el espaciado entre caídas sea similar.
   3. Repita los pasos 2.2.1 y 2.2.2 para tantas réplicas como desee.
3. Vacíe 1 vial de ~100 moscas hambrientas en una almohadilla de CO₂ el tiempo suficiente para anestesiar a todos los animales (aproximadamente 10 seg). Cepille a los animales en medio de una cámara de ensayo preparada y cubra con la tapa del plato.
   NOTA: Se deben evitar períodos más largos de exposición al CO₂ para mejorar el tiempo de recuperación y limitar la interferencia con el comportamiento de alimentación. La exposición al hielo (~5 min) se puede utilizar para anestesiar para evitar efectos conductuales de CO₂ que pueden surgir incluso de una exposición limitada.
4. Coloque la cámara de ensayo en una caja de cartón opaca. Asegúrese de etiquetar el exterior de la caja con la condición y el genotipo que se están probando.
5. Coloque toda la configuración (cámara de ensayo contenida dentro de la caja de cartón desde el paso 2.4) en una incubadora de 25 °C con al menos un 70% de humedad durante 2 horas.
6. Repita los pasos del 2.3 al 2.5 para todas las réplicas.
7. Después de 2 horas, coloque las cámaras de ensayo, todavía contenidas dentro de cajas de cartón, directamente en un congelador de -20 °C hasta que estén listas para la cuantificación.

3. Cuantificación del ensayo de preferencias de sabor

1. Permita que una sola cámara de ensayo se caliente a temperatura ambiente (aproximadamente 5 min).
2. Bajo un microscopio de disección, utilizando un pincel o par de fórceps, agrupa animales en función del color de su abdomen: rojo, azul, púrpura o claro(Figura 1).
3. Registre el número de animales en cada agrupación. Considere que los animales claros no han participado en el ensayo y, por lo tanto, no los incluyen en ningún cálculo.
4. Calcule el índice de preferencias según una de las siguientes ecuaciones:
   1. Si el tacstant experimental de interés se añade al tinte rojo, a continuación, utilice (N_rojo + 0.5N_púrpura) / (N_rojo + N_azul + N_púrpura).
   2. Si el tacante experimental se añade al tinte azul, a continuación, ajuste la ecuación a (N_azul + 0.5N_púrpura) / (N_azul + N_rojo + N_púrpura).
5. Repita los cálculos para todas las condiciones y réplicas experimentales.

4. Optimización del ensayo de preferencias de sabor

1. Determinar empíricamente la concentración de los indicadores de coloración de los alimentos que se utilizarán para que la coloración de los alimentos no afecte al resultado del ensayo de sabor, de la siguiente manera:
   1. Prepare 4 tastants utilizando el mismo compuesto base(por ejemplo, sacarosa de 5 mM) como se indica en el paso 2.1, pero omita la coloración del alimento.
   2. Agregue un 1,3% de coloración roja de alimentos a uno de los tastants. Hacer los 3 tastantes restantes con colorante de alimentos azules de diferentes concentraciones en cada tubo(por ejemplo, 0,6%, 1% y 1,3%).
   3. Pasos de protocolo completos 2.2 a 3.4 para cada par de tacstant: 1.3% rojo contra 0.6% azul; 1,3% rojo frente a 1% azul y 1,3% rojo frente a 1,3% azul.
   4. Repita el paso 4.1.1-4.1.3 con diferentes porcentajes de coloración de alimentos azules hasta que el índice de preferencias promedia un valor de 0 (Figura 2).
      NOTA: Como punto de partida, el colorante rojo del 1,3% de los alimentos junto con el colorante de los alimentos azules del 1% suelen dar buenos resultados. Si ninguna concentración satisfactoria de coloración de los alimentos azules se puede comparar con un tinte del 1,3%, entonces el paso 4.1.1 a 4.1.3 se puede repetir con concentraciones variables de coloración roja y una concentración constante de coloración de alimentos azules.
   5. Analice todas las condiciones a probar con las mismas concentraciones optimizadas para colorear los alimentos.

Representative Results

Figura 1: Pruebe los resultados del ensayo de preferencias. Se muestran algunos ejemplos en la variación de la coloración abdominal. Rojo oscuro ingerido (A). Rojo claro ingerido (B). Azul oscuro ingerido (C). Azul claro ingerido (D). Los abdomens morados se consideran cuando toda la coloración aparece púrpura (E), o cuando regiones distintas del abdomen muestran partes de rojo (punta de flecha) y partes separadas de azul (flecha) (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Control de los efectos de coloración de los alimentos. La adición de colorante alimentario a los tacstantes no debe tener ningún efecto en la preferencia de sabor de los animales. Variar la concentración de tinte azul manteniendo una concentración constante de tinte rojo reveló una combinación óptima de 1.3% rojo a 1.0% azul. Esto se indica mediante un valor de índice de preferencias cercano a 0,5. Los valores son la media ± desviación estándar. *p < 0.05, ***p < 0.001 de la prueba t del estudiante de dos lados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160