Smagspræference assay: En metode til måling af fodringsadfærd i Drosophila

Overview

Denne video beskriver smagspræferenceanalysen, en adfærdsmetode, der bruges til at måle tiltrækning eller undgåelse mod farvede opløsninger, der smager anderledes ved at vurdere fluens abdominale farve efter indtagelse af det foretrukne stof. Den udvalgte protokol viser den procedure, der anvendes til at måle fluernes præference i retning af opløsninger af forskellige saccharosekoncentrationer.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Bantel og Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. Sult

1. Forbered flue sult hætteglas ved at mætte en bomuldskugle med 18,2 MΩ vand i bunden af en standard flyve hætteglas. Alternativt kan du ligeledes mætte en lille strimmel filterpapir med 18,2 MΩ vand og placere i en vinkel i hætteglasset.
2. Saml fluer i sæt af ~ 100 dyr på en CO₂ pad og derefter tilføje fluer til en forberedt hætteglas.
   BEMÆRK: De bedste resultater opnås med dyr, der er mindre end 5 dage gamle. Dyrenes nøjagtige alder kan dog kontrolleres som en eksperimentel variabel for at bestemme ændringer i smagspræferencen over tid.
3. Brug en bomuldskugle eller skumprop til at sikre hætteglassene lukket. Placer hætteglas på deres side i en miljøkontrolleret inkubator. Temperaturen skal fastholdes ved 25 °C og fugtigheden over 70 %. Lad hætteglas være urørt i 24 timer.

2. Smag Præference Assay

1. Forbered alle smagsstoffer til analysen samme dag som test.
   BEMÆRK: De nøjagtige smagsstoffer, der skal anvendes, vil variere afhængigt af eksperimentelle spørgsmål, der stilles. Følgende er eksempler på smagsstoffer, der anvendes i denne protokol. Se afsnit 4 for optimeringer.
   1. Forbered kontrolstændelsesmiddel (1 mM saccharose) ved at kombinere 10 μl 100 mM saccharoseopløsning, 13 μl rød levnedsmiddelfarve og 977 μl 18,2 MΩ vand.
   2. Der fremstilles eksperimentelt smagsstof (5 mM saccharose) ved at kombinere 50 μl 100 mM saccharoseopløsning, 10 μl blå levnedsmiddelfarve og 940 μl 18,2 MΩ vand.
2. Der fremstilles analysekamre med en standard petriskål på 100 mm x 15 mm, tilberedt på følgende måde:
   1. Der anbringes tre 10 μl dråber kontrolptant nærmest pladens kant klokken 12 og yderligere 3 dråber kl. Sørg for, at afstanden mellem dråberne er den samme.
   2. Der anbringes tre 10 μl dråber eksperimentelt smagsstof nærmest pladens kant klokken 3 og yderligere 3 dråber kl. Sørg for, at afstanden mellem dråberne er den samme.
   3. Gentag trin 2.2.1 og 2.2.2 for så mange replikater som ønsket.
3. Tom 1 hætteglas af ~ 100 udsultede fluer på en CO₂ pad lige længe nok til at bedøve alle dyr (ca. 10 sek). Børst dyrene ind i midten af et forberedt analysekammer og dæk med skållåget.
   BEMÆRK: Længere perioder med CO_{2-eksponering} bør undgås for at forbedre restitutionstiden og begrænse interferensen med fodringsadfærden. Udsættelse for is (~5 min)kan anvendes til bedøvelse for at undgå CO₂ adfærdsmæssige virkninger, der kan opstå som følge af selv begrænset eksponering.
4. Placer analysekammeret i en uigennemsigtig papkasse. Sørg for at mærke ydersiden af kassen med den tilstand og genotype, der testes.
5. Hele opsætningen (analysekammeret i papkassen fra trin 2.4) anbringes i en inkubator på 25 °C med mindst 70 % fugtighed i 2 timer.
6. Gentag trin 2.3 til 2.5 for alle replikater.
7. Efter 2 timer anbringes analysekamrene, der stadig er indeholdt i papkasser, direkte i en fryser på -20 °C, indtil de er klar til kvantificering.

3. Smag Præference Assay kvantificering

1. Lad et enkelt analysekammer varme op til stuetemperatur (ca. 5 minutter).
2. Under et dissektionsmikroskop ved hjælp af en børste eller et par pincet, gruppedyr baseret på farven på deres underliv: rød, blå, lilla eller klar (Figur 1).
3. Registrer antallet af dyr i hver gruppering. Overvej, at klare dyr ikke har deltaget i analysen og derfor ikke inkluderer dem i nogen beregninger.
4. Beregn præferenceindekset i henhold til en af følgende ligninger:
   1. Hvis den eksperimentelle smag af interesse tilsættes til det røde farvestof, skal du bruge (N_rød + 0,5N lilla)/(N_rød + N_blå + N_lilla).
   2. Hvis det eksperimentelle smagsstof tilsættes det blå farvestof, skal ligningen justeres til (N_blå + 0,5N lilla)/(N_blå + N_rød + N_lilla).
5. Gentag beregningerne for alle forsøgsbetingelser og replikater.

4. Optimering af smagspræference assay

1. Empirisk bestemme koncentrationen af fødevarer farve indikatorer, der skal anvendes, så fødevarer farve påvirker ikke resultatet af smag assay, som følger:
   1. Der fremstilles 4 smagsstoffer ved hjælp af samme basisforbindelse(f.eks. 5 mM saccharose) som angivet i trin 2.1, men udelad fødevarefarven.
   2. Tilsæt 1,3% rød madfarve til en af smagsstofferne. Gør de resterende 3 tastanter med blå mad farve af varierende koncentrationer i hvert rør(f.eks 0,6%, 1% og 1,3%).
   3. Komplet protokol trin 2,2 til 3,4 for hver tastant par: 1,3% rød vs 0,6% blå; 1,3% rød vs. 1% blå og 1,3% rød vs. 1,3% blå.
   4. Gentag trin 4.1.1-4.1.3 med forskellige procentdele af farvelægning af blå fødevarer, indtil præferenceindekset beregner gennemsnittet af en værdi på 0 (Figur 2).
      BEMÆRK: Som udgangspunkt giver 1,3% rød madfarve kombineret med 1% blå madfarve typisk gode resultater. Hvis ingen tilfredsstillende koncentration af blå mad farve kan matches til 1,3% farvestof, så trin 4.1.1 til 4.1.3 kan gentages med varierende koncentrationer af rød farve og en konstant koncentration af blå mad farve.
   5. Analyser alle forhold, der skal testes med de samme optimerede fødevarefarvekoncentrationer.

Representative Results

Figur 1: Resultater af smagspræferenceanalyse. Nogle eksempler i variationen af abdominal farve er vist. Mørkerød indtaget (A). Lys rød indtaget (B). Mørkeblå indtaget (C). Lyseblå indtaget (D). Lilla maver tages i betragtning, når hele farvningen vises lilla (E), eller når forskellige områder af maven viser dele af rød (pilespids) og separate dele af blå (pil) (F). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Kontrol for fødevarefarveeffekter. Tilsætning af madfarve til smagsstofferne bør ikke have nogen effekt på dyrenes smagspræference. Varierende koncentrationen af blå farvestof og samtidig opretholde en konstant koncentration af rødt farvestof afslørede en optimal kombination af 1,3% rød til 1,0% blå. Dette angives med en præferenceindeksværdi nær 0,5. Værdier er middelværdien ± standardafvigelsen. * p < 0,05, *** p < 0,001 fra to-sidet studerendes t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160