העדפת טעם Assay: שיטה למדידת התנהגות האכלה ב Drosophila

Overview

סרטון זה מתאר את העדפת הטעם, שיטה התנהגותית המשמשת למדידת משיכה או הימנעות מפתרונות צבעוניים בעלי טעם שונה על ידי הערכת צבע הבטן של הזבוב לאחר בליעה של החומר המועדף. הפרוטוקול המוצג מדגים את ההליך המשמש למדידת העדפת זבובים לפתרונות של ריכוזי סוכרוז משתנים.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Bantel ו Tessier, טעם העדפה Assay עבור Drosophila למבוגרים, J. Vis. Exp. (2016).

1. רעב

1. הכינו בקבוקוני רעב לעוף על ידי הרוויה של כדור צמר גפן עם 18.2 מים MΩ בתחתית בקבוקון זבוב סטנדרטי. לחלופין, באופן דומה לרוויה רצועה קטנה של נייר מסנן עם 18.2 מים MΩ ומניחים בזווית בתוך הבקבוקון.
2. לאסוף זבובים לתוך סטים של ~ 100 בעלי חיים על כרית CO₂ ולאחר מכן להוסיף את הזבובים בקבוקון מוכן.
   שים לב: התוצאות הטובות ביותר מתקבלות עם בעלי חיים בני פחות מ -5 ימים. עם זאת, הגיל המדויק של בעלי החיים ניתן לשלוט כמשתנה ניסיוני כדי לקבוע שינויים בהעדפת הטעם לאורך זמן.
3. השתמש בכדור צמר גפן או פקק קצף כדי לאבטח את הבקבוקונים סגורים. מניחים בקבוקונים על צידם באינקובטור מבוקר לסביבה. לשמור על הטמפרטורה ב 25 °C (69 °F), ואת הלחות מעל 70%. השאירו בקבוקונים ללא שינוי למשך 24 שעות.

2. העדפת טעם Assay

1. הכינו את כל הטעמים לבדיקה באותו יום של הבדיקה.
   שים לב: הטעמים המדויקים שישמשו ישתנו בהתאם לשאלה הניסיונית הנשאלת. להלן דוגמאות לטעימות המשמשות בפרוטוקול זה. עיין בסעיף 4 למיטובים.
   1. הכן טסטנט בקרה (1 mM סוכרוז) על ידי שילוב של 10 μl של 100 מ"מ סוכרוז פתרון, 13 μl של צבע מאכל אדום, ו 977 μl של 18.2 מ"ל מים.
   2. הכן טעים ניסיוני (5 mM סוכרוז) על ידי שילוב של 50 μl של 100 מ"מ סוכרוז פתרון, 10 μl של צבעי מאכל כחולים, ו 940 μl של 18.2 מ"ל מים.
2. הפוך את תאי ההסמכה באמצעות צלחת פטרי פלסטיק סטנדרטית של 100 מ"מ x 15 מ"מ שהוכנה באופן הבא:
   1. מניחים שלוש טיפות 10 μl של טעים שליטה הקרוב ביותר לקצה הצלחת בשעה 12 ועוד 3 טיפות בשעה 6. ודא שהמרווח בין הטיפות דומה.
   2. מניחים שלוש טיפות 10 μl של טעים ניסיוני הקרוב ביותר לקצה הצלחת בשעה 3 ו 3 טיפות נוספות בשעה 9. ודא שהמרווח בין הטיפות דומה.
   3. חזור על שלבים 2.2.1 ו- 2.2.2 עבור מספר השכפולים הרצוי.
3. ריק 1 בקבוקון של ~ 100 זבובים מורעבים על כרית CO₂ רק מספיק זמן כדי להרדים את כל בעלי החיים (כ 10 שניות). מברישים את החיות לאמצע תא חקירה מוכן ומכסים במכסה הכלים.
   שים לב: יש להימנע מתקופות ארוכות יותר של חשיפה_{ל-CO 2} כדי לשפר את זמן ההחלמה ולהגביל את ההפרעה להתנהגות ההזנה. חשיפה לקרח (~ 5 דקות) עשויה לשמש להמתת חסד כדי למנוע השפעות התנהגותיות CO₂ שעלולות לנבוע אפילו מחשיפה מוגבלת.
4. מניחים את תא ההסתעפות בקופסת קרטון אטומה. הקפד לתייג את החלק החיצוני של התיבה עם המצב והגנוטיפ הנבדקים.
5. מניחים את ההתקנה כולה (תא assay הכלול בתוך קופסת קרטון משלב 2.4) לתוך אינקובטור 25 מעלות צלזיוס עם לפחות 70% לחות במשך 2 שעות.
6. חזור על שלבים 2.3 עד 2.5 עבור כל השכפולים.
7. לאחר שעתיים, מניחים את תאי ההסמכה, שעדיין כלולים בתוך קופסאות קרטון, ישירות במקפיא של -20 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לכימות.

3. כימות מבחני העדפת טעם

1. אפשר לתא בדיקת יחיד להתחמם לטמפרטורת החדר (כ -5 דקות).
2. תחת מיקרוסקופ ניתוק, באמצעות מברשת או זוג מלקחיים, מקבץ בעלי חיים לפי צבע הבטן שלהם: אדום, כחול, סגול או ברור (איור 1).
3. רשום את מספר בעלי החיים בכל קיבוץ. שקול בעלי חיים ברורים שלא השתתפו במהלך ההסתעפות ולכן אינם כוללים אותם בחישובים כלשהם.
4. חשב את אינדקס ההעדפות לפי אחת מהמשוואות הבאות:
   1. אם הטעם הניסיוני של עניין מתווסף צבע אדום, ולאחר מכן להשתמש_{(N אדום} + 0.5N_סגול)/(N_אדום +_{N כחול} +_{N סגול).}
   2. אם הטעימות הניסיוניות מתווספות לצבע הכחול, יש להתאים את המשוואה ל- (N_blue + 0.5N_סגול)/(N_כחול +_{N אדום} +_{N סגול).}
5. חזור על החישובים עבור כל התנאים והשכפולים הניסיוניים.

4. אופטימיזציה של העדפת טעם Assay

1. באופן אמפירי לקבוע את הריכוז של מדדי צבעי מאכל לשמש כך צבעי מאכל אינו משפיע על התוצאה של בדיקת הטעם, כדלקמן:
   1. הכן 4 טעים באמצעות אותו תרכובת בסיס(למשל 5 mM סוכרוז) כפי שצוין בשלב 2.1, אבל להשמיט את צבעי מאכל.
   2. מוסיפים 1.3% צבעי מאכל אדומים לאחד הטעמים. הפוך את 3 tastants הנותרים עם צבע מאכל כחול של ריכוזים שונים בכל צינור(למשל 0.6%, 1%, ו 1.3%).
   3. פרוטוקול מלא שלבים 2.2 עד 3.4 עבור כל זוג טעים: 1.3% אדום לעומת 0.6% כחול; אדום 1.3% לעומת 1% כחול ו-1.3% אדום לעומת 1.3% כחול.
   4. חזור על שלב 4.1.1-4.1.3 עם אחוזים שונים של צבעי מאכל כחולים עד שמדד ההעדפות יהיה ממוצע של 0 (איור 2).
      שים לב: כנקודת מוצא, 1.3% צבעי מאכל אדומים בשילוב עם 1% צבע מאכל כחול בדרך כלל מניב תוצאות טובות. אם אין ריכוז משביע רצון של צבע מאכל כחול ניתן להתאים 1.3% צבע, אז שלב 4.1.1 עד 4.1.3 ניתן לחזור עם ריכוזים שונים של צבע אדום ריכוז קבוע של צבעי מאכל כחולים.
   5. לנתח את כל התנאים להיבדק עם אותם ריכוזי צבע מזון ממוטבים.

Representative Results

איור 1: תוצאות הבדיקה של העדפת הטעם. כמה דוגמאות וריאציה של צביעת בטן מוצגים. אדום כהה בלע (A). אדום בהיר בלע (B). כחול כהה בלע(C). כחול בהיר בלע(D). בטן סגולה נחשבת כאשר הצבע כולו מופיע סגול (E), או כאשר אזורים נפרדים של הבטן מראים חלקים של אדום (ראש חץ) וחלקים נפרדים של כחול(חץ)( F ). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: בקרה על אפקטי צבעי מאכל. לתוספת צבעי מאכל לטעימות לא אמורה להיות השפעה כלשהי על העדפת הטעם של בעלי החיים. שינוי הריכוז של צבע כחול תוך שמירה על ריכוז קבוע של צבע אדום גילה שילוב אופטימלי של 1.3% אדום עד 1.0% כחול. ערך זה מצוין על-ידי ערך מדד העדפה ליד 0.5. ערכים הם הממוצע ± סטיית תקן. *p < 0.05, ***p < 0.001 ממבחן t של תלמיד דו-צדדי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160