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Encyclopedia of Experiments

Saggio di preferenza del gusto: un metodo per misurare il comportamento di alimentazione in Drosophila

Overview

Questo video descrive il saggio delle preferenze di gusto, un metodo comportamentale utilizzato per misurare l'attrazione o l'elusione verso soluzioni colorate che hanno un sapore diverso valutando la colorazione addominale della mosca dopo l'ingestione della sostanza preferita. Il protocollo in primo piano dimostra la procedura utilizzata per misurare la preferenza delle mosche verso soluzioni di diverse concentrazioni di saccarosio.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Bantel e Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila,J. Vis. Exp. 

1. Fame

  1. Preparare fiale di fame a mosca saturando un batuffolo di cotone con acqua da 18,2 MΩ sul fondo di una fiala a mosca standard. In alternativa, saturare allo stesso modo una piccola striscia di carta da filtro con acqua da 18,2 MΩ e posizionarsi ad angolo all'interno del flaconcino.
  2. Raccogli le mosche in set di ~ 100 animali su untampone di CO 2 e quindi aggiungi le mosche a una fiala preparata.
    NOTA: I migliori risultati si ottengono con animali di età inferiore a 5 giorni. Tuttavia, l'età esatta degli animali può essere controllata come variabile sperimentale per determinare i cambiamenti nella preferenza del gusto nel tempo.
  3. Utilizzare un batuffolo di cotone o un tappo di schiuma per fissare le fiale chiuse. Posizionare le fiale dalla loro parte in un incubatore controllato dall'ambiente. Mantenere la temperatura a 25 °C e l'umidità superiore al 70%. Lasciare le fiale intatte per 24 ore.

2. Saggio di preferenza del gusto

  1. Preparare tutti i tastant per il saggio lo stesso giorno del test.
    NOTA: I tastant esatti da utilizzare varieranno a seconda delle domande sperimentali poste. Di seguito sono riportato i tastant di esempio utilizzati in questo protocollo. Vedi sezione 4 per le ottimizzazioni.
    1. Preparare il tastant di controllo (1 mM di saccarosio) combinando 10 μl di soluzione di saccarosio da 100 mM, 13 μl di colorante alimentare rosso e 977 μl di acqua da 18,2 MΩ.
    2. Preparare il tastante sperimentale (saccarosio da 5 mM) combinando 50 μl di soluzione di saccarosio da 100 mM, 10 μl di colorante alimentare blu e 940 μl di acqua da 18,2 MΩ.
  2. Fare camere di dosaggio utilizzando una piastra di petri di plastica standard da 100 mm x 15 mm preparata nel modo seguente:
    1. Posizionare tre gocce da 10 μl di tastant di controllo più vicino al bordo della piastra a ore 12 e altre 3 gocce a ore 6. Assicurarsi che la spaziatura tra le gocce sia simile.
    2. Posizionare tre gocce da 10 μl di tastant sperimentale più vicino al bordo della piastra a ore 3 e altre 3 gocce a ore 9. Assicurarsi che la spaziatura tra le gocce sia simile.
    3. Ripetere i passaggi 2.2.1 e 2.2.2 per tutte le repliche desiderate.
  3. Vuoto 1 flaconcino di ~ 100 mosche affamate su un pad di CO2 abbastanza a lungo da anestetizzare tutti gli animali (circa 10 secondi). Spazzolare gli animali nel mezzo di una camera di dosaggio preparata e coprire con il coperchio del piatto.
    NOTA: Periodi più lunghi di esposizione alla CO2 dovrebbero essere evitati per migliorare i tempi di recupero e limitare le interferenze con il comportamento di alimentazione. L'esposizione al ghiaccio (~5 min) può essere utilizzata per l'anestetizzazione per evitare effetticomportamentali di CO 2 che possono derivare da un'esposizione anche limitata.
  4. Posizionare la camera di dosaggio in una scatola di cartone opaca. Assicurarsi di etichettare l'esterno della scatola con la condizione e il genotipo in fase di test.
  5. Posizionare l'intera configurazione (camera di dosaggio contenuta all'interno della scatola di cartone dal passaggio 2.4) in un incubatore a 25 °C con almeno il 70% di umidità per 2 ore.
  6. Ripetere i passaggi da 2.3 a 2.5 per tutte le repliche.
  7. Dopo 2 ore, posizionare le camere di dosaggio, ancora contenute all'interno di scatole di cartone, direttamente in un congelatore a -20 °C fino a quando non sono pronte per la quantificazione.

3. Quantificazione del saggio di preferenza del gusto

  1. Lasciare riscaldare una singola camera di dosaggio a temperatura ambiente (circa 5 min).
  2. Al microscopio a dissezione, utilizzando un pennello o un paio di forcep, gli animali di gruppo in base al colore del loro addome: rosso, blu, viola o chiaro (Figura 1).
  3. Registrare il numero di animali in ogni gruppo. Considera che gli animali chiari non hanno partecipato al saggio e quindi non li includono in alcun calcolo.
  4. Calcolare l'indice delle preferenze in base a una delle seguenti equazioni:
    1. Se il tastant sperimentale di interesse viene aggiunto al colorante rosso, utilizzare (Nrosso + 0,5Nviola)/(Nrosso + Nblu + Nviola).
    2. Se il tastante sperimentale viene aggiunto al colorante blu, regolare l'equazione su (Nblu + 0,5Nviola)/(Nblu + Nrosso + Nviola).
  5. Ripetere i calcoli per tutte le condizioni sperimentali e le repliche.

4. Ottimizzazione del saggio delle preferenze di gusto

  1. Determinare empiricamente la concentrazione di indicatori di colorazione degli alimenti da utilizzare in modo che la colorazione degli alimenti non influenzi il risultato del saggio del gusto, come segue:
    1. Preparare 4 tastant utilizzando lo stesso composto di base(ad esempio saccarosio da 5 mM) come indicato al passaggio 2.1, ma omettere la colorazione degli alimenti.
    2. Aggiungere l'1,3% di colorazione del cibo rosso a uno dei tastant. Effettuare i restanti 3 tastant con colorazione blu degli alimenti di diverse concentrazioni in ciascun tubo(ad esempio 0,6%, 1% e 1,3%).
    3. Passaggi completi del protocollo da 2,2 a 3,4 per ogni coppia di tastant: 1,3% rosso vs 0,6% blu; 1,3% rosso contro 1% blu e 1,3% rosso contro 1,3% blu.
    4. Ripetere il passaggio 4.1.1-4.1.3 con diverse percentuali di colorazione degli alimenti blu fino a quando l'indice di preferenza non ha una media di valore pari a 0 (Figura 2).
      NOTA: Come punto di partenza, la colorazione del cibo rosso dell'1,3% abbinata alla colorazione blu del cibo dell'1% produce in genere buoni risultati. Se nessuna concentrazione soddisfacente della colorazione degli alimenti blu può essere abbinata a colorante all'1,3%, il passaggio da 4.1.1 a 4.1.3 può essere ripetuto con diverse concentrazioni di colorazione rossa e una concentrazione costante di colorante alimentare blu.
    5. Analizza tutte le condizioni da testare con le stesse concentrazioni ottimizzate di colorazione degli alimenti.

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Representative Results

Figure 1
Figura 1: Risultati del saggio delle preferenze di gusto. Vengono mostrati alcuni esempi nella variazione della colorazione addominale. Rosso scuro ingerito (A). Rosso chiaro ingerito (B). Blu scuro ingerito (C). Azzurro ingerito (D). Gli addome viola sono considerati quando l'intera colorazione appare viola ( E ),oquando regioni distinte dell'addome mostrano porzioni di rosso (punta di freccia) e porzioni separate di blu (freccia) (F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Controllo degli effetti della colorazione degli alimenti. L'aggiunta di coloranti alimentari ai tastant non dovrebbe avere alcun effetto sulla preferenza di gusto degli animali. Variando la concentrazione di colorante blu pur mantenendo una concentrazione costante di colorante rosso ha rivelato una combinazione ottimale tra 1,3% rosso e 1,0% blu. Questo è indicato da un valore dell'indice di preferenza vicino a 0,5. I valori sono la ± deviazione standard. *p < 0,05, ***p < 0,001 dal test t dello studente su due lati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben) McCormick N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers Fisher 03-395-455
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope W. Nuhsbaum, Inc. 10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm) BD Falcon 351029 Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes Alkali Scientific Inc. C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben) McCormick N/A
Sucrose IBI Scientific IB37160

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Saggio di preferenza del gusto: un metodo per misurare il comportamento di alimentazione <em>in Drosophila</em>
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Fonte: Bantel, A. P. and Tessier, C. R. Taste Preference Assay for Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (2016).

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