Вкус Предпочтение Анализ: Метод измерения поведения кормления в Drosophila

Overview

Это видео описывает анализ вкусовых предпочтений, поведенческий метод, используемый для измерения притяжения или избегания к цветным решениям, которые по-разному вкус, оценивая окраску брюшной полости мухи после приема предпочтительного вещества. Рекомендуемый протокол демонстрирует процедуру, используемую для измерения предпочтений мух к решениям различных концентраций сахарозы.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Bantel и Tessier, Вкус Предпочтение Анализ для взрослых Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. Голод

1. Подготовка летать голода флаконы, насыщая ватный шарик с 18,2 МЗ воды в нижней части стандартного флакона мухи. Кроме того, аналогичным образом насытить небольшую полоску фильтровальной бумаги с 18,2 МЗ воды и место под углом во флаконе.
2. Соберите мух в наборы животных в размере 100 фунтов стерлингов на площадке CO_2, а затем добавьте мух в подготовленный флакон.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшие результаты получены с животными, которые менее 5 дней. Тем не менее, точный возраст животных можно контролировать в качестве экспериментальной переменной для определения изменений в вкусовых предпочтениях с течением времени.
3. Используйте ватный шарик или пенопластовую пробку, чтобы обеспечить закрытые флаконы. Поместите флаконы на бок в экологически контролируемом инкубаторе. Поддерживайте температуру при температуре 25 градусов по Цельсию, а влажность выше 70%. Оставьте флаконы нетронутыми в течение 24 часов.

2. Вкус Предпочтение Анализ

1. Подготовьте все вкусы к анализу в тот же день, что и тестирование.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точные вкусы, которые будут использоваться будет варьироваться в зависимости от экспериментального вопроса задают. Ниже приведены примеры вкусности, используемые в этом протоколе. См раздел 4 для оптимизации.
   1. Подготовь контрольный вкус (1 мМ сахароза), объединив 10 мкл раствора сахарозы 100 мМ, 13 мкл красной пищевой красителя и 977 мкл из 18,2 МЗ воды.
   2. Приготовьте экспериментальный вкус (5 мМ сахарозы), объединив 50 мкл раствора сахарозы 100 мМ, 10 мкл синей пищевой красителя и 940 мкл из 18,2 МЗ воды.
2. Сделать анализ камер с использованием стандартного 100 мм х 15 мм пластиковые чашки Петри подготовлены следующим образом:
   1. Поместите три 10 мкл капли контроля вкусный ближайший край пластины в 12 часов и еще 3 капли в 6 часов. Убедитесь, что расстояние между каплями аналогично.
   2. Поместите три 10 мкл капли экспериментального вкусного ближайшего края пластины на 3 часа и еще 3 капли в 9 часов. Убедитесь, что расстояние между каплями аналогично.
   3. Повторите шаги 2.2.1 и 2.2.2 для столько репликаций, сколько пожелает.
3. Пустой 1 флакон из 100 голодных мух на CO₂ площадку достаточно долго, чтобы обезболить всех животных (примерно 10 сек). Кисть животных в середине подготовленной камеры анализа и накрыть крышкой блюда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать более длительных периодов воздействия CO_2, чтобы улучшить время восстановления и ограничить помехи в поведении кормления. Воздействие льда (5 мин) может быть использовано для анестезии, чтобы избежать_{со-2 поведенческих эффектов,} которые могут возникнуть в результате даже ограниченного воздействия.
4. Поместите камеру анализа в непрозрачную картонную коробку. Не забудьте обозначить внешнюю часть коробки с условием и генотипом, тестируются.
5. Поместите всю установку (камера анализа, содержащаяся в картонной коробке от шага 2.4) в инкубатор 25 градусов по Цельсию с влажностью не менее 70% в течение 2 часов.
6. Повторите шаги от 2,3 до 2,5 для всех репликаций.
7. Через 2 часа поместите камеры анализа, все еще содержащиеся в картонных коробках, прямо в морозильную камеру -20 градусов по Цельсию до готовности к количественной оценке.

3. Вкус Предпочтение Анализ Количественная оценка

1. Разрешить одну камеру анализа, чтобы согреться до комнатной температуры (примерно 5 мин).
2. Под микроскопом вскрытия, используя кисть или пару типсов, группируют животных в зависимости от цвета живота: красного, синего, фиолетового или ясного(рисунок 1).
3. Запись количества животных в каждой группировке. Считайте, что явные животные не участвовали в анализе и поэтому не включают их ни в какие расчеты.
4. Рассчитайте индекс предпочтений в соответствии с одним из следующих уравнений:
   1. Если экспериментальный вкус интереса добавляется к красному красителю, то используйте_(N красный цвет 0.5N_{фиолетовый})/(N_{красный} и N_синий n_{фиолетовый}).
   2. Если экспериментальный вкус добавляется к синему красителю, то отрегулируйте уравнение до (N_синий - 0,5Nфиолетовый)/(N_{синий n-красный n-фиолетовый).}
5. Повторите расчеты для всех экспериментальных условий и репликаций.

4. Оптимизация анализа вкусовых предпочтений

1. Эмпирически определить концентрацию пищевых красителей индикаторов, которые будут использоваться, чтобы пищевые красители не влияют на результат анализа вкуса, а именно:
   1. Приготовьте 4 вкусанта, используя то же базовое соединение (например, 5 мм сахарозы), как указано в шаге 2.1, но опустить пищевой краситель.
   2. Добавьте 1,3% красный пищевой краситель к одному из вкусовых. Сделайте оставшиеся 3 вкусанта с синей пищевой окраской различной концентрации в каждойтрубке (например, 0,6%, 1% и 1,3%).
   3. Полный протокол шаги 2,2 до 3,4 для каждой вкусной пары: 1,3% красный против 0,6% синий; 1,3% красный против 1% синий и 1,3% красный против 1,3% синий.
   4. Повторите шаг 4.1.1-4.1.3 с различными процентами синей пищевой окраски до тех пор, пока индекс предпочтений не усреднел значение 0(рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве отправной точки, 1,3% красный пищевой краситель в сочетании с 1% синий пищевой краситель, как правило, дает хорошие результаты. Если нет удовлетворительной концентрации синей пищевой красителя может быть совенено с 1,3% красителя, то шаг 4.1.1 до 4.1.3 может быть повторен с различной концентрацией красной окраски и постоянной концентрацией синей пищевой окраски.
   5. Проанализируйте все условия для тестирования с одинаковыми оптимизированными концентрациями пищевой красителя.

Representative Results

Рисунок 1: Вкус предпочтения анализ результатов. Приведены некоторые примеры вариации окраски брюшной полости. Темно-красный попадает (A). Светло-красный попадает (B). Темно-синий попадает (C). Светло-голубой попадает (D). Фиолетовые животы рассматриваются, когда вся окраска появляетсяфиолетовый( E ), или когда различные области живота показывают части красного (стрелка) и отдельные части синего (стрелка) (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Контроль за эффектами окраски пищевых продуктов. Добавление пищевой краситель к вкусу не должно иметь никакого влияния на вкусовые предпочтения животных. Изменение концентрации синего красителя при сохранении постоянной концентрации красного красителя выявило оптимальное сочетание 1,3% красного до 1,0% синего. Об этом свидетельствует значение индекса предпочтений вблизи 0,5. Значения являются средним ± отклонения. 0,05 евро, 0,001 от двухстороннего студента t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160