Smakpreferensanalys: En metod för att mäta utfodringsbeteende i Drosophila

Overview

Denna video beskriver smakpreferensanalysen, en beteendemetod som används för att mäta attraktion eller undvikande mot färgade lösningar som smakar annorlunda genom att bedöma flugans bukfärgning efter intag av det föredragna ämnet. Det presenterade protokollet visar det förfarande som används för att mäta flugornas preferens framför lösningar av varierande sackaroskoncentrationer.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Bantel och Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. Svält

1. Förbered flugsvältflaskan genom att mätta en bomullstuss med 18,2 MΩ vatten i botten av en vanlig flugflaska. Alternativt mätta på samma sätt en liten remsa filterpapper med 18,2 MΩ vatten och placera i en vinkel inuti injektionsflaskan.
2. Samla flugor i uppsättningar av ~ 100 djur på en CO_2-pad och tillsätt sedan flugorna till en förberedd flaska.
   OBS: Bästa resultat erhålls med djur som är mindre än 5 dagar gamla. Djurens exakta ålder kan dock kontrolleras som en experimentell variabel för att bestämma förändringar i smakpreferensen över tid.
3. Använd en bomullstuss eller skumpropp för att säkra de stängda injektionsflaskan. Placera injektionsflaskan på sidan i en miljökontrollerad inkubator. Håll temperaturen vid 25 °C och luftfuktigheten över 70%. Lämna injektionsflaskan orörd i 24 timmar.

2. Smakpreferensanalys

1. Förbered alla smakprov för analysen samma dag som testningen.
   OBS: De exakta smaksätten som ska användas varierar beroende på vilken experimentell fråga som ställs. Följande är exempel på tastanter som används i det här protokollet. Se avsnitt 4 för optimeringar.
   1. Förbered kontroll tastant (1 mM sackaros) genom att kombinera 10 μl 100 mM sackaroslösning, 13 μl röd matfärgning och 977 μl 18,2 MΩ vatten.
   2. Förbered experimentell tastant (5 mM sackaros) genom att kombinera 50 μl 100 mM sackaroslösning, 10 μl blå matfärgning och 940 μl 18,2 MΩ vatten.
2. Gör analyskammare med en standard petriskål av 100 mm x 15 mm plast som bereds på följande sätt:
   1. Placera tre 10 μl droppar kontroll tastant närmast kanten av plattan klockan 12 och ytterligare 3 droppar klockan 6. Se till att avståndet mellan dropparna är liknande.
   2. Placera tre 10 μl droppar experimentell tastant närmast kanten av plattan klockan 3 och ytterligare 3 droppar klockan 9. Se till att avståndet mellan dropparna är liknande.
   3. Upprepa steg 2.2.1 och 2.2.2 för så många replikat som önskas.
3. Töm 1 flaska ~100 svältande flugor på en CO_2-dyna tillräckligt länge för att bedöva alla djur (ca 10 sek). Borsta djuren i mitten av en förberedd analyskammare och täck med skållocket.
   OBS: Längre perioder av CO_2-exponering bör undvikas för att förbättra återhämtningstiden och begränsa störningar i utfodringsbeteendet. Exponering för is (~5 min) kan användas för bedövning för att undvika CO₂ beteendemässiga effekter som kan uppstå till följd av även begränsad exponering.
4. Placera analyskammaren i en ogenomskinlig kartong. Var noga med att märka utsidan av lådan med villkoret och genotypen testas.
5. Placera hela installationen (analyskammaren i kartongen från steg 2.4) i en inkubator på 25 °C med minst 70 % luftfuktighet i 2 timmar.
6. Upprepa steg 2.3 till 2.5 för alla replikat.
7. Efter 2 timmar placera analyskamrarna, som fortfarande finns i kartonger, direkt i en -20 °C frys tills de är klara för kvantifiering.

3. Kvantifiering av smakpreferenser

1. Låt en enda analyskammare värmas upp till rumstemperatur (ca 5 min).
2. Under ett dissekeringsmikroskop, med hjälp av en borste eller ett par tångar, grupperar djur baserat på bukens färg: röd, blå, lila eller klar (Figur 1).
3. Registrera antalet djur i varje gruppering. Tänk på att tydliga djur inte har deltagit i analysen och därför inte inkluderar dem i några beräkningar.
4. Beräkna inställningsindexet enligt någon av följande ekvationer:
   1. Om den experimentella tastanten av intresse läggs till det röda färgämnet, använd sedan (N_röd + 0,5N_lila)/(N_röd + N_blå + N_lila).
   2. Om den experimentella tastanten läggs till det blå färgämnet, justera sedan ekvationen till (N_blå + 0,5N lila)/(N_blå + N_röd + N_lila).
5. Upprepa beräkningarna för alla experimentella tillstånd och replikat.

4. Optimering av smakpreferensanalys

1. Bestäm empiriskt koncentrationen av färgindikatorer för livsmedel som ska användas så att matfärgning inte påverkar resultatet av smakanalysen enligt följande:
   1. Bered 4 smakämnen med samma basförening(t.ex. 5 mM sackaros) enligt steg 2.1, men utelämna matfärgningen.
   2. Tillsätt 1,3% röd matfärgning till en av tastanterna. Gör de återstående 3 smakämnena med blå matfärgning av olika koncentrationer i varje rör(t.ex. 0,6%, 1% och 1,3%).
   3. Slutför protokoll steg 2.2 till 3.4 för varje tastant par: 1.3% röd vs. 0.6% blå; 1,3% rött jämfört med 1% blått och 1,3% rött jämfört med 1,3% blått.
   4. Upprepa steg 4.1.1-4.1.3 med olika procentandelar färgning av blå mat tills inställningsindexet i genomsnitt är 0(figur 2).
      OBS: Som utgångspunkt ger 1,3% röd matfärgning i kombination med 1% blå matfärgning vanligtvis bra resultat. Om ingen tillfredsställande koncentration av blå matfärgning kan matchas till 1,3% färgämne, kan steg 4.1.1 till 4.1.3 upprepas med varierande koncentrationer av röd färgning och en konstant koncentration av blå matfärgning.
   5. Analysera alla förhållanden som ska testas med samma optimerade färgkoncentrationer av livsmedel.

Representative Results

Figur 1: Resultat av smakpreferensanalys. Några exempel i variationen av bukfärgning visas. Mörkrött intas (A). Ljusröd intag (B). Mörkblå intas (C). Ljusblå intas (D). Lila bukar beaktas när hela färgningen verkar lila (E), eller när distinkta delar av buken visar delar av rött (pilspets) och separata delar av blått (pil) (F). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Kontroll för matfärgningseffekter. Tillsats av matfärgning till tastanterna bör inte ha någon effekt på djurens smakpreferens. Varierande koncentrationen av blått färgämne samtidigt som man upprätthåller en konstant koncentration av rött färgämne visade en optimal kombination av 1,3% röd till 1,0% blå. Detta indikeras av ett preferensindexvärde nära 0,5. Värden är medelvärdet ± standardavvikelse. *p < 0,05, ***p < 0,001 från tvåsidiga studenters t-test. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160