Tat Tercihi Tahlil: Drosophila'da Beslenme Davranışını Ölçme Yöntemi

Overview

Bu videoda, tercih edilen maddenin yutulması sonrasında sineğin karın renklendirmesini değerlendirerek farklı tat alan renkli çözümlere yönelik çekim veya kaçınmayı ölçmek için kullanılan bir davranışsal yöntem olan tat tercihi tahlili açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol, sineklerin değişen sakkaroz konsantrasyonlarının çözeltilerine olan tercihini ölçmek için kullanılan prosedürü göstermektedir.

Protocol

Bu protokol Bantel ve Tessier'den bir alıntıdır, Yetişkin Drosophilaiçin Tat Tercih Tahlili,J. Vis. Exp. (2016). 

1. Açlık

1. Standart bir sinek şişesinin dibinde 18,2 MΩ su ile bir pamuk topunu doyurarak sinek açlığı şişeleri hazırlayın. Alternatif olarak, benzer şekilde 18,2 MΩ su ile küçük bir filtre kağıdı şeridini doyur ve şişenin içindeki bir açıya yerleştirin.
2. Sinekleri bir CO₂ pedinde ~ 100 hayvan setlerine toplayın ve ardından sinekleri hazırlanmış bir şişeye ekleyin.
   NOT: En iyi sonuçlar 5 günden daha küçük hayvanlarla elde edilir. Bununla birlikte, hayvanların tam yaşı, zaman içinde tat tercihinde değişiklikleri belirlemek için deneysel bir değişken olarak kontrol edilebilir.
3. Şişeleri kapalı sabitlemek için pamuklu bir top veya köpük durdurucu kullanın. Şişeleri çevre kontrollü bir inkübatöre yanlarına yerleştirin. Sıcaklığı 25 °C'de ve nemi% 70'in üzerinde koruyun. Şişeleri 24 saat boyunca el değmeden bırakın.

2. Tat Tercihi Tahlili

1. Testle aynı gün tastantları test için hazırlayın.
   NOT: Kullanılacak tam şok tabancaları, sorulan deneysel soruya bağlı olarak değişecektir. Aşağıda, bu iletişim kuralında kullanılan örnek uyarıcılar verilmiştir. İyileştirmeler için bölüm 4'e bakın.
   1. 10 μl 100 mM sakkaroz çözeltisi, 13 μl kırmızı gıda renklendirmesi ve 977 μl 18,2 MΩ suyu birleştirerek kontrol püskülünü (1 mM sakkaroz) hazırlayın.
   2. 50 μl 100 mM sakkaroz çözeltisi, 10 μl mavi gıda renklendirmesi ve 940 μl 18,2 MΩ suyu birleştirerek deneysel tastant (5 mM sakkaroz) hazırlayın.
2. Aşağıdaki şekilde hazırlanmış standart 100 mm x 15 mm plastik petri kabı kullanarak tahlil odaları yapın:
   1. Saat 12'de plakanın kenarına en yakın üç 10 μl kontrol damlası ve saat 6'da 3 damla daha yerleştirin. Damlalar arasındaki aralığın benzer olduğundan emin olun.
   2. Saat 3'te plakanın kenarına en yakın üç 10 μl'lik deneysel şok damlası ve saat 9'da 3 damla daha yerleştirin. Damlalar arasındaki aralığın benzer olduğundan emin olun.
   3. İstediğiniz sayıda çoğaltma için 2.2.1 ve 2.2.2 adımlarını yineleyin.
3. Boş 1 şişe ~100 aç sinek, tüm hayvanları uyuşturacak kadar uzun bir CO₂ pedi üzerine uçar (yaklaşık 10 sn). Hayvanları hazırlanmış bir tahlil odasının ortasına fırçalayın ve bulaşık kapağı ile örtün.
   NOT: İyileşme süresini iyileştirmek ve beslenme davranışına müdahaleyi sınırlamak için daha uzun CO₂ maruziyeti dönemlerinden kaçınılmalıdır. Buza maruz kalma (~5 dk), sınırlı maruziyetten bile kaynaklanabilecek CO₂ davranışsal etkilerinden kaçınmak için anestezi için kullanılabilir.
4. Test odasını opak bir karton kutuya yerleştirin. Kutunun dışını test edilen koşul ve genotiple etiketleyin.
5. Tüm kurulumu (adım 2.4'ten itibaren karton kutunun içinde bulunan tahlil odası) 2 saat boyunca en az% 70 neme sahip 25 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
6. Tüm yinelemeler için 2.3 ile 2.5 arasında olan adımları yineleyin.
7. 2 saat sonra, hala karton kutularda bulunan test odalarını, miktara hazır olana kadar doğrudan -20 ° C dondurucuya yerleştirin.

3. Tat Tercihi Tahlil Nicelemesi

1. Tek bir test odasının oda sıcaklığına (yaklaşık 5 dk) ısınmasına izin verin.
2. Diseksiyon mikroskobu altında, bir fırça veya bir çift toka kullanarak, hayvanları karınlarının rengine göre gruplayın: kırmızı, mavi, mor veya net (Şekil 1).
3. Her gruplandırmada hayvan sayısını kaydedin. Teste katılmamış açık hayvanları düşünün ve bu nedenle onları herhangi bir hesaplamaya dahil etmeyin.
4. Tercih dizinini aşağıdaki denklemlerden birine göre hesaplayın:
   1. Kırmızı boyaya deneysel ilgi alanı eklenirse, kullanın (N_kırmızı + 0,5N_mor)/(N_kırmızı + N_mavi + N_mor).
   2. Deneysel şok tabancası mavi boyaya eklenirse, denklemi (N_mavi + 0,5N mor)/(N_mavi + N_kırmızı + N_mor)olarak ayarlayın.
5. Tüm deneysel koşullar ve çoğaltmalar için hesaplamaları tekrarlayın.

4. Tat Tercih Tahlilinin Optimizasyonu

1. Gıda renklendirmenin tat testinin sonucunu etkilememesi için kullanılacak gıda renklendirici göstergelerinin konsantrasyonunun ampirik olarak belirlenmesi aşağıdaki gibi:
   1. Adım 2.1'de belirtildiği gibi aynı baz bileşiği(örneğin 5 mM sakkaroz) kullanarak 4 şok tabancası hazırlayın, ancak gıda renklendirmesini atlayın.
   2. Püsküllerden birine% 1.3 kırmızı gıda boyası ekleyin. Kalan 3 tastant'ı her tüpte değişen konsantrasyonlarda mavi gıda renklendirmesi ile yapın(örneğin% 0.6, % 1 ve% 1.3).
   3. Her bir lezzetli çift için 2.2 ile 3.4 arasındaki protokol adımlarını tamamlayın: % 1.3 kırmızı ve% 0.6 mavi; %1,3 kırmızıya karşılık %1 mavi ve %1,3 kırmızı ve %1,3 mavi.
   4. Tercih indeksi ortalama değeri 0 olana kadar mavi gıda renklendirmesinin farklı yüzdeleriyle 4.1.1-4.1.3 adımını yineleyin (Şekil 2).
      NOT: Başlangıç noktası olarak, % 1.3 kırmızı gıda renklendirmesi ve% 1 mavi gıda renklendirmesi tipik olarak iyi sonuçlar verir. Mavi gıda renklendirmesinin tatmin edici konsantrasyonu% 1.3 boya ile eşleştirilemezse, 4.1.1 ila 4.1.3 adımı, değişen kırmızı renklendirme konsantrasyonları ve sürekli mavi gıda renklendirme konsantrasyonu ile tekrarlanabilir.
   5. Aynı optimize edilmiş gıda boyama konsantrasyonları ile test edilecek tüm koşulları analiz edin.

Representative Results

Şekil 1: Tat tercihi tahlil sonuçları. Abdominal renklendirme varyasyonunda bazı örnekler gösterilmiştir. Koyu kırmızı yutmuş (A). Açık kırmızı yutmuş (B). Koyu mavi yutmuş (C). Açık mavi yutmuş (D). Mor karınlar, tüm renklendirme mor (E) göründüğünde veya karnın farklı bölgeleri kırmızı (ok ucu) ve ayrı mavi (ok)(F)kısımlarını gösterdiğinde dikkate alınır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Gıda renklendirme etkilerinin kontrol edilmesi. Lezzetlilere yiyecek renklendirmesinin eklenmesi, hayvanların lezzet tercihi üzerinde herhangi bir etkiye sahip olmamalıdır. Sabit bir kırmızı boya konsantrasyonu korunurken mavi boya konsantrasyonunun değişmesi, % 1.3 kırmızı ila% 1.0 mavinin optimum bir kombinasyonunu ortaya çıkardı. Bu, 0,5'e yakın bir tercih dizini değeriyle gösterilir. Değerler standart sapmanın ortalaması ±. *p < 0.05, ***p < 0.001 iki taraflı öğrencinin t-testinden. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160