Larvale lymfklierdissectie: het isoleren van het Drosophila Hemocyt-producerende orgaan

Overview

Deze video beschrijft de Drosophila-lymfklier - de primaire plaats van hematopoiese in de vlieglarve - en toont een voorbeeldprotocol om het orgaan te ontleden en te monteren voor immunohistochmie en fluorescerende beeldvorming.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Reimels en Pfleger, Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016).

1. Larvale Lymfklier Immunohistochie

OPMERKING: De lymfeklier bevindt zich ongeveer een derde lengte van het voorste uiteinde van een larve iets onder de hersenen aan de dorsale kant. (Zie pijl in figuur 1B.) De lymfeklier flankeert het dorsale vat en is het gemakkelijkst te ontleden aan de mondhaken of aan de hersenen. Wild-type, derde instar lymfeklieren zijn zeer kleine structuren; de primaire lobben zijn ongeveer 100 - 200 μm lang. (Zie figuur 2A.)

1. Om larven van ongeveer hetzelfde ontwikkelingsstadium voor deze test te verkrijgen, beperkt u de eierverzameling door vrouwtjes toe te staan eieren te leggen voor een vaste periode van 2 - 6 uur.
2. Lymfeklierdissectie
   1. Voeg voor elke experimentele toestand 1 ml 1x PBS (tabel 1) toe aan één put van een 24-putplaat.
   2. Voeg 1 druppel van 0,1% PBST(tabel 1)toe aan elke put met behulp van een wegwerptransferpipet.
      OPMERKING: Wasmiddel, zoals Tween 20, wordt toegevoegd om de oppervlaktespanning te verlagen, waardoor het weefsel naar de bodem van de put kan zinken.
   3. Leg de plaat plat op ijs.
   4. Verzamel larven in ontledende schotelputten gevuld met 1x PBS.
   5. Plaats een schone ontleedpad op een verlichte stereomicroscoopbasis. Gebruik een wegwerptransferpipet om kleine druppels van 0,01% PBST(tabel 1)op de pad te plaatsen. Breng een larve over naar een PBST-druppel voor dissectie.
   6. Houd de larve met één paar tangen ongeveer een kwart lengte van het achterste uiteinde, dorsale kant naar boven.
   7. Gebruik een ander paar tangen om de nagelriem onmiddellijk vooraan vast te pakken aan de tang die de larve vasthoudt. Trek de nagelriem voorzichtig naar het voorste uiteinde totdat de mondhaken worden blootgesteld.
      OPMERKING: Het doel is om de nagelriem te schillen zonder interne structuren te verstoren.
   8. Laat de nagelriem los en gebruik beide tangen om de larve in tweeën te snijden. Verwijder het achterste uiteinde van de PBST-drop.
      OPMERKING: Als de nagelriem niet helemaal naar de mondhaken pelt, snijdt u de larve in tweeën en verwijdert u het achterste uiteinde. Gebruik een tang om de rand van de nagelriem vast te houden en gebruik het andere paar tangen om de mondhaken door de opening te duwen. Dit zal de nagelriem omkeren en de mondhaken blootstellen. Dit kan ook worden gebruikt als een alternatieve dissectiemethode.
   9. Gebruik één tang om de nagelriem vast te pinnen (de ventrale cuticula, de dorsale nagelriemflap of beide) voor stabiliteit.
   10. Gebruik nog een tang om de blootgestelde mondhaken vast te pakken en trek ze er voorzichtig uit.
       OPMERKING: Dit zal de cuticula scheiden van de interne structuren. Idealiter blijven de oog-/antenneschijven, hersenen, ringklier en lymfeklier die het rugvat flankeren, aan de mondhaken bevestigd.
   11. Terwijl u nog steeds de mondhaken vasthoudt, verwijdert u zorgvuldig ongewenste structuren zoals de speekselklieren, het vetlichaam en de darm.
       OPMERKING: Als de hersenen zich scheiden van de mondhaken, kan de lymfeklier nog steeds worden bevestigd aan en verzameld met de hersenen. Houd in dit geval het ventrale zenuwkoord vast in plaats van de mondhaken.
   12. Gebruik de mondhaken of het ventrale zenuwkoord als handvat en breng het ontlede complex met de lymfeklier over naar de put op ijs. Niet meer dan 30 minuten voor fixatie.
3. Fixatie en immunohistochie
   1. Plaats de 24-put plaat op de stereomicroscoop basis.
   2. Gebruik een p200 pipet om de PBST voorzichtig uit de put te verwijderen.
      OPMERKING: Lege, naburige putten zijn handig om tijdelijk afval te deponeren.
   3. Voeg voorzichtig 200 μl 3,7% formaldehyde(tabel 1)langs de zijkant van de put toe en draai de plaat om ervoor te zorgen dat de ontlede weefsels volledig onder water staan.
   4. Zet de plaat 30 minuten terug in het ijs. Als de lymfeklieren fluorescerende eiwitten uitdrukken, houdt u de plaat bedekt om fotobleaching te voorkomen.
   5. Gebruik een p200 pipet om het fixatief voorzichtig te verwijderen.
   6. Was door 200 μl 1x PBS aan de put toe te voegen en de plaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale shaker te plaatsen. Gebruik een p200 pipet om de PBS voorzichtig te verwijderen.
      OPMERKING: Vaste lymfeklieren kunnen in PBS op ijs worden achtergelaten totdat lymfeklieren voor alle experimentele aandoeningen zijn ontleed en gefixeerd.
   7. Herhaal de wasstappen nog twee keer.
   8. Voeg 200 μl permeabilisatieoplossing (tabel 1) toe aan de put. Zet de plaat op een orbitale shaker gedurende 45 minuten bij RT.
      OPMERKING: 45 min is de "gouden standaard" voor lymfeklierpermeabilisatie, maar de auteurs hebben succes na slechts 20 minuten.
   9. Verwijder de oplossing met een p200 pipet.
   10. Verdun primair antilichaam met antilichaamoplossing (tabel 1) volgens de specificaties van de leverancier. Voeg 300 μl primaire antilichaamoplossing toe aan de put en zorg ervoor dat de ontlede weefsels volledig onder water staan. Incubeer 's nachts bij 4 °C.
   11. Gebruik een p200 pipet om het primaire antilichaam te verwijderen.
   12. Was door 200 μl 1x PBS aan de put toe te voegen en de plaat gedurende 10 minuten op een orbitale shaker bij kamertemperatuur te plaatsen. Gebruik een p200 pipet om de PBS voorzichtig te verwijderen.
   13. Herhaal de wasstappen nog twee keer.
   14. Verdun secundair antilichaam met antilichaamoplossing volgens de specificaties van de leverancier. Voeg 300 μl secundaire antilichaamoplossing toe aan de put en zorg ervoor dat de ontlede weefsels volledig onder water staan. Incubeer minstens 2 uur op een orbitale shaker bij RT.
   15. Gebruik een p200 pipet om het secundaire antilichaam te verwijderen en te wassen zoals beschreven in stap 1.3.12 & 1.3.13. Verwijder de PBS niet na de laatste wasbeurt.
4. Lymfklier montage
   1. Reinig glazen microscoopglaasjes met 70% ethanol(tabel 1)en tissuedoekjes.
   2. Plaats voor elke experimentele toestand één druppel montagebuffer (tabel 1) op de glazen glijbaan.
      OPMERKING: Twee voorwaarden passen op één dia. Het montagebuffervolume is afhankelijk van het aantal te monteren lymfeklieren. Gebruik 2 μl voor ongeveer 18 - 20 lymfeklieren, 1 μl voor 10 - 12 en 0,5 μl voor 5 of minder.
   3. Plaats de microscoopschuif op een verlichte stereomicroscoopbasis.
   4. Breng voor maximaal twee aandoeningen tegelijk alle lymfeklieren van de put naar de montagebuffer met een tang, met behulp van de mondhaken of het ventrale zenuwkoord als handvat.
   5. Verdeel de ontlede weefsels gelijkmatig in een cirkelvormige of rechthoekige vorm, waardoor de montagebuffer tijdens het proces wordt verspreid.
   6. Schuif voor elk van de ontlede weefsels afzonderlijk één tang van de tang onder het rugvat en trek voorzichtig naar de periferie van de montagebuffer.
      OPMERKING: Dit zal de lymfeklier uit de rest van de ontleedde weefsels trekken en de lymfklier op het glas plat maken.
   7. Snijd met behulp van een tang van de tang en een zaagbeweging het rugvat tussen de lymfklier en de hersenen.
   8. Verplaats de rest van de ontlede weefsels naar de andere kant van de lymfeklier, aan de buitenste rand van de buffer.
      OPMERKING: De ongewenste ontleedde weefsels zullen uiteindelijk een omtrek rond de lymfeklieren vormen en dienen als ondersteuning waarop de deklip zal rusten.
   9. Herhaal dit totdat alle lymfeklieren zijn gescheiden van de ontlede weefsels, waarbij een van de ongewenste ontlede weefsels in het midden wordt gereserveerd.
   10. Neem een coverslip tussen twee vingers. Controleer of de afdeklip vrij is van stof en vingerafdrukken. Gebruik indien nodig een tissue wipe en 70% ethanol om de coverslip schoon te maken.
   11. Zorg ervoor dat de rand van de afdeklip evenwijdig is aan de rand van de glasschuif en laat de afdeklip voorzichtig over de montagebuffer zakken.
       OPMERKING: Microscoopglaasjes kunnen bij 4 °C worden opgeslagen voordat ze worden gebeeldopt. De maximale opslagtijd is afhankelijk van de stabiliteit van de gebruikte antilichamen. 24-put platen kunnen worden gespoeld en hergebruikt.

2. Beeldvorming

1. Afbeelding vaste hemocyten en gemonteerde lymfeklieren op een geschikte standaard fluorescentie of confocale microscoop bij 20X of hogere vergroting volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Afbeelding hele larven op een standaard stereomicroscoop bij 2x vergroting volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.
2. Volg indien gewenst de instructies van de softwareleverancier voor deconvolutie.

Representative Results

Figuur 1: In Vivo Crystal Cell Melanisatie. A) Larven werden vóór het verwarmen afzonderlijk in PCR-buizen geplaatst. Rode pijlen wijzen op larven die zich niet aan de onderkant van de buizen bevinden. B) Een typisch kristalcelmelanisatiepatroon na verhitting, dat soms de lymfeklier onthult (pijl; dorsale kant getoond, voorste is links). Schaalbalk staat voor 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Larvale lymfklier immunohistochie. A) Een DIC-afbeelding van een derde instar larvale lymfklier met het dorsale vat (dv), primaire kwabben (1°) en secundaire kwabben (2°). Schaalbalk vertegenwoordigt 100 μm. B) Een representatieve derde instar larvale lymfklier van een larve die EBFP2 genetisch uitdrukt in de medullaire zone en GFP in het achterste signaleringscentrum. De lymfeklier was bevlekt met een antilichaam tegen het inkepings intracellulaire domein (rood). Ongewijzigd beeld dat met een fluorescentiemicroscoop (bovenkant) wordt genomen. Dezelfde afbeelding na deconvolutie (onder). Schaalbalken vertegenwoordigen 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
microscope cover glass, 18 mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1