ניתוח בלוטת הלימפה הזחל: בידוד האיבר המייצר המוציטה Drosophila

Overview

סרטון זה מתאר את בלוטת הלימפה Drosophila – האתר העיקרי של hematopoiesis בזחל הזבוב – ומציג פרוטוקול לדוגמה כדי לנתח ולהרכיב את האיבר עבור אימונוהיסטוכימיה והדמיה פלואורסצנטית.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך ריימלס ו Pfleger, שיטות לבחון את בלוטת הלימפה ואת המוציטים בזחלים Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. אימונוהיסטוכימיה של בלוטת הלימפה הזחלית

שים לב: בלוטת הלימפה ממוקמת כשליש מהקצה החיצוני של זחל מעט מתחת למוח בצד הגבי. (ראה חץ באיור 1B). בלוטת הלימפה מאגפת את כלי הגב והיא מנותח בקלות רבה מחובר ווים בפה או למוח. סוג פראי, בלוטות הלימפה instar השלישי הם מבנים קטנים מאוד; האונות העיקריות הן כ 100 - 200 מיקרומטר אורך. (ראה איור 2א' א')

1. כדי להשיג זחלים של בערך באותו שלב התפתחותי עבור סקירה זו, להגביל את איסוף הביצים על ידי מתן אפשרות לנקבות להטיל ביצים לתקופה קבועה של 2 - 6 שעות.
2. ניתוח בלוטת הלימפה
   1. עבור כל מצב ניסיוני, להוסיף 1 מיליליטר 1x PBS(טבלה 1)לבאר אחת של צלחת 24-well.
   2. הוסף 1 טיפה של 0.1% PBST (טבלה 1) לכל באר באמצעות צינור העברה חד פעמי.
      שים לב: חומר ניקוי, כגון Tween 20, מתווסף כדי להוריד את מתח פני השטח, ומאפשר לרקמה לשקוע לתחתית הבאר.
   3. מניחים את הצלחת שטוחה על קרח.
   4. לאסוף זחלים בארות צלחת ניתוח מלא 1x PBS.
   5. הנח משטח ניתוח נקי על בסיס סטריאומיקרוסקופ מואר. השתמש בצינור העברה חד פעמי כדי למקם טיפות קטנות של 0.01% PBST (טבלה 1) על הכרית. העבר זחל אחד לטיפת PBST לצורך ניתוח.
   6. החזק את הזחל עם זוג אחד של מלקחיים בערך רבע אורך מהקצה האחורי, צד הגב למעלה.
   7. השתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי לתפוס את הקוטיקולה מיד לפני המלקחיים המחזיקים את הזחל. מושכים בעדינות את הקוטיקולה לכיוון הקצה העדין עד שהווים בפה נחשפים.
      שים לב: המטרה היא לקלף את הקוטיקל מבלי להפריע למבנים פנימיים.
   8. שחררו את הקוטיקל והשתמשו בשני המלקחיים כדי לחתוך את הזחל לשניים. הסר את הקצה האחורי מההוצאה של PBST.
      שים לב: אם הקוטיקולה לא מקלפת את כל הדרך אל ווים הפה, לחתוך את הזחל לשניים ולהסיר את הקצה האחורי. השתמש בזוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את קצה הקוטיקל, והשתמש בזוג המלקחיים האחר כדי לדחוף את ווים הפה דרך הפתח. זה יהפוך את הקוטיקל ויחשוף את וו הפה. ניתן להשתמש באפשרות זו גם כשיטת ניתוח חלופית.
   9. השתמש בזוג מלקחיים אחד כדי להצמיד את הקוטיקל (או את קוטיקל הגחוני, את דש הקוטיקל הגבי, או את שניהם) ליציבות.
   10. השתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי לתפוס את ווים הפה חשוף בעדינות למשוך אותם החוצה.
       שים לב: זה יפריד את הקוטיקל מהמבנים הפנימיים. באופן אידיאלי, הדיסקים הדמיון העין / אנטנה, המוח, בלוטת הטבעת, בלוטת הלימפה אגף כלי הגב יישאר מחובר ווים בפה.
   11. בעוד עדיין מחזיק את ווים הפה, להסיר בזהירות מבנים לא רצויים כגון בלוטות הרוק, גוף השומן, המעי.
       שים לב: אם המוח נפרד מהפה ווים, בלוטת הלימפה עדיין עשוי להיות מחובר שנאסף עם המוח. במקרה זה, להחזיק את חוט העצבים הגחוני במקום ווים בפה.
   12. באמצעות ווים הפה או חוט העצבים הגחוני כמו ידית, להעביר את קומפלקס מנותח המכיל את בלוטת הלימפה לבאר על הקרח. אין לחרוג מ- 30 דקות לפני הקיבעון.
3. קיבוע ואימונוהיסטוכימיה
   1. מניחים את הצלחת 24-well על בסיס סטריאומיקרוסקופ.
   2. השתמש פיפטה p200 כדי להסיר בזהירות את PBST מהבאר.
      שים לב: בארות ריקות, שכנות שימושיות להפקדה זמנית של פסולת.
   3. בעדינות להוסיף 200 μl 3.7% פורמלדהיד(טבלה 1)בצד של הבאר מערבולת הצלחת כדי להבטיח כי הרקמות מנותחות שקועים לחלוטין.
   4. מחזירים את הצלחת לקרח למשך 30 דקות. אם בלוטות הלימפה מבטאות חלבונים פלואורסצנטיים, שמרו על הצלחת מכוסה כדי למנוע פוטובלצ'ינג.
   5. השתמש פיפטה p200 כדי להסיר בזהירות את התיקון.
   6. לשטוף על ידי הוספת 200 μl 1x PBS לבאר והנחת הצלחת על שייקר מסלולית במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש פיפטה p200 כדי להסיר בזהירות את PBS.
      שים לב: בלוטות לימפה קבוע ניתן להשאיר על קרח PBS עד בלוטות הלימפה עבור כל התנאים הניסיוניים מנותחים ומתוקנים.
   7. חזור על שלבי הכביסה פעמיים נוספות.
   8. הוסף 200 μl פתרון חדירה (טבלה 1) לבאר. הגדר את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 45 דקות ב RT.
      הערה: 45 דקות הוא "תקן זהב" עבור חדירת בלוטת הלימפה אבל המחברים יש הצלחה לאחר רק 20 דקות.
   9. הסר את הפתרון עם פיפטה p200.
   10. לדלל נוגדן ראשוני עם פתרון נוגדנים (טבלה 1) על פי מפרטי הספק. הוסף 300 μl פתרון נוגדנים ראשוני לבאר ולהבטיח כי הרקמות מנותח שקועים לחלוטין. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
   11. השתמש פיפטה p200 כדי להסיר את הנוגדן העיקרי.
   12. לשטוף על ידי הוספת 200 μl 1x PBS לבאר ומניחים את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש פיפטה p200 כדי להסיר בזהירות את PBS.
   13. חזור על שלבי הכביסה פעמיים נוספות.
   14. לדלל נוגדן משני עם פתרון נוגדנים על פי מפרטי הספק. הוסף פתרון נוגדנים משני 300 μl לבאר ולהבטיח כי הרקמות מנותח שקועים לחלוטין. דגירה על שייקר מסלולית לפחות 2 שעות ב RT.
   15. השתמש פיפטה p200 כדי להסיר את הנוגדן המשני לשטוף כמתואר בשלבים 1.3.12 & 1.3.13. אין להסיר את ה- PBS לאחר הכביסה הסופית.
4. הרכבה על בלוטת הלימפה
   1. שקופיות מיקרוסקופ זכוכית נקיות באמצעות 70% אתנול (טבלה 1) ומגבוני רקמות.
   2. עבור כל מצב ניסיוני, הנח טיפה אחת של מאגר הרכבה(טבלה 1)על שקופית הזכוכית.
      שים לב: שני תנאים מתאימים לשקופית אחת. נפח חיץ הרכבה תלוי במספר בלוטות הלימפה להיות מותקן. השתמש 2 μl עבור כ 18 - 20 בלוטות הלימפה, 1 μl עבור 10 - 12, ו 0.5 μl עבור 5 או פחות.
   3. הנח את שקופית המיקרוסקופ על בסיס סטריאומיקרוסקופ מואר.
   4. עבור עד שני תנאים בכל פעם, להעביר את כל בלוטות הלימפה מן הבאר אל חיץ הרכבה עם מלקחיים, באמצעות ווים בפה או חוט העצבים הגחוני כמו ידית.
   5. חלל את הרקמות מנותח באופן שווה בצורה מעגלית או מלבנית, הפצת חיץ הרכבה בתהליך.
   6. עבור כל אחת מהרקמות המנותחות, בנפרד, החלק טונג אחד של המלקחיים מתחת לכלי הגב ומשוך בעדינות לכיוון הפריפריה של חיץ ההרכבה.
      שים לב: זה ימשוך את בלוטת הלימפה משאר הרקמות מנותחות לשטח את בלוטת הלימפה על הזכוכית.
   7. באמצעות טונג אחד של המלקחיים ותנועת ניסור, לחתוך את כלי הגב בין בלוטת הלימפה והמוח.
   8. להעביר את שאר הרקמות מנותח לצד הנגדי של בלוטת הלימפה, בקצה החיצוני ביותר של החיץ.
      שים לב: הרקמות המנותחות הלא רצויות יהוו בסופו של דבר היקף סביב בלוטות הלימפה וישמשו כתמיכה שעליה ינוח הכיסוי.
   9. חוזרים על הפעולה עד שכל בלוטות הלימפה מופרדות מהרקמות המנותקות, שומרות את אחת הרקמות המנותקות הלא רצויות למקום במרכז.
   10. קח כיסוי בין שתי אצבעות. ודאו שהכיסוי נקי מאבק וטביעות אצבעות. במידת הצורך, יש להשתמש במגבון רקמה וב-70% אתנול לניקוי הכיסוי.
   11. כדי להבטיח שקצה ה-coverslip יהיה מקביל לקצה שקופית הזכוכית, הנמך בזהירות את החלקה מעל מאגר ההרכבה.
       שים לב: שקופיות מיקרוסקופ ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה. זמן האחסון המרבי תלוי ביציבות הנוגדנים המשמשים. ניתן לשטוף צלחות 24 באר ו לעשות בה שימוש חוזר.

2. הדמיה

1. תמונה קבועה hemocytes ובלוטות לימפה רכוב על פלואורסצנטיות סטנדרטית מתאימה או מיקרוסקופ confocal ב 20X ומעלה הגדלה על פי מדריך ההפעלה של היצרן. זחלים שלמים של תמונה על סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי בהגדלה פי 2 בהתאם למדריך ההפעלה של היצרן.
2. בצע את הוראות ספק התוכנה לפירוק, אם תרצה בכך.

Representative Results

איור 1: במלניזציה של תאי קריסטל Vivo. A) זחלים הונחו בנפרד בצינורות PCR לפני החימום. חצים אדומים מציינים זחלים שאינם בתחתית הצינורות. ב) דפוס מלניזציה טיפוסי של תאי גביש לאחר החימום, אשר לפעמים חושף את בלוטת הלימפה (חץ; צד הגב המוצג, צד שני נשאר). סרגל קנה המידה מייצג 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אימונוהיסטוכימיה של בלוטת הלימפה הזחלית. A) תמונה DIC של בלוטת הלימפה זחל כוכב שלישי מראה את כלי הגב (dv), האונות העיקריות (1° ), ואונות משניות (2°). סרגל סולם מייצג 100 מיקרומטר. B) מייצג שלישי instar זחל בלוטת הלימפה מזחל גנטית מבטא EBFP2 באזור medullary ו GFP במרכז איתות האחורי. בלוטת הלימפה הוכתמה בנוגדן נגד התחום תאיים חריץ (אדום). תמונה ללא שינוי שצולמה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי (למעלה). אותה תמונה לאחר פירוק (למטה). סרגלי קנה מידה מייצגים 20 מיקרומטר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
microscope cover glass, 18 mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1