Dissezione della ghiandola linfatica larvale: isolamento dell'organo produttore di emociti Drosophila

Overview

Questo video descrive la ghiandola linfaca drosofila - il sito primario dell'ematopoiesi nella larva della mosca - e mostra un protocollo di esempio per sezionare e montare l'organo per l'immunoistochimica e l'imaging fluorescente.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Reimels e Pfleger, Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp.

1. Immunoistochimica della ghiandola linfale larvale

NOTA: La ghiandola linfatico si trova a circa un terzo di lunghezza dall'estremità anteriore di una larva leggermente sotto il cervello sul lato dorsale. (Vedere freccia nella figura 1B. ) La ghiandola linfatico fiancheggia il vaso dorsale ed è più facilmente sezionata attaccata ai ganci della bocca o al cervello. Le ghiandole linfatiche di tipo selvatico, terze instar, sono strutture molto piccole; i lobi primari hanno una lunghezza di circa 100-200 μm. (Cfr. figura 2A.

1. Per ottenere larve di circa lo stesso stadio di sviluppo per questo saggio, limitare la raccolta delle uova consentendo alle femmine di deporre le uova per un periodo di tempo fisso di 2 - 6 ore.
2. Dissezione della ghiandola linfatica
   1. Per ogni condizione sperimentale, aggiungere 1 ml 1x PBS(tabella 1)a un pozzo di una piastra da 24 pozza.
   2. Aggiungere 1 goccia dello 0,1% di PBST (Tabella 1) a ciascun pozzo utilizzando una pipetta di trasferimento usa e getta.
      NOTA: Il detergente, come Tween 20, viene aggiunto per abbassare la tensione superficiale, consentendo al tessuto di affondare sul fondo del pozzo.
   3. Posizionare il piatto piatto sul ghiaccio.
   4. Raccogliere le larve nella sezionatura dei pozzi dei piatti riempiti con 1x PBS.
   5. Posizionare una sezionatura pulita su una base stereomicroscopica illuminata. Utilizzare una pipetta di trasferimento usa e getta per posizionare piccole gocce dello 0,01% di PBST (Tabella 1) sul pad. Trasferire una larva in una goccia PBST per la dissezione.
   6. Tenere la larva con un paio di forcep di circa un quarto di lunghezza dall'estremità posteriore, lato dorsale verso l'alto.
   7. Usa un altro paio di forcep per afferrare la cuticola immediatamente anteriore alle forcep che tengono la larva. Tirare delicatamente la cuticola verso l'estremità anteriore fino a quando i ganci della bocca sono esposti.
      NOTA: L'obiettivo è quello di sbucciare la cuticola senza disturbare alcuna struttura interna.
   8. Rilasciare la cuticola e utilizzare entrambe le forcep per tagliare la larva in due. Rimuovere l'estremità posteriore dalla caduta PBST.
      NOTA: Se la cuticola non si stacca fino ai ganci della bocca, tagliare la larva in due e rimuovere l'estremità posteriore. Utilizzare una coppia di forcep per tenere il bordo della cuticola e utilizzare l'altra coppia di forcep per spingere i ganci della bocca attraverso l'apertura. Questo invertirà la cuticola ed esporrà i ganci della bocca. Questo può essere utilizzato anche come metodo di dissezione alternativo.
   9. Usa un paio di pin per fissare la cuticola (la cuticola ventrale, il lembo della cuticola dorsale o entrambi) per la stabilità.
   10. Utilizzare un altro paio di forcep per afferrare i ganci della bocca esposti e tirarli delicatamente fuori.
       NOTA: Ciò separerà la cuticola dalle strutture interne. Idealmente, i dischi immaginabili occhio/antennale, il cervello, la ghiandola ad anello e la ghiandola linfaica che fiancheggiano il vaso dorsale rimarranno attaccati ai ganci della bocca.
   11. Mentre si tengono ancora i ganci della bocca, rimuovere con cura strutture indesiderate come le ghiandole salivari, il corpo grasso e l'intestino.
       NOTA: Se il cervello si separa dai ganci della bocca, la ghiandola linfatico potrebbe ancora essere attaccata e raccolta con il cervello. In questo caso, tenere il cordone nervoso ventrale invece dei ganci della bocca.
   12. Usando i ganci della bocca o il cordone nervoso ventrale come maniglia, trasferire il complesso sezionato contenente la ghiandola linfatico al pozzo sul ghiaccio. Non superare i 30 minuti prima della fissazione.
3. Fissazione e immunoistochimica
   1. Posizionare la piastra da 24 punti sulla base stereomicroscopica.
   2. Utilizzare una pipetta p200 per rimuovere con cura il PBST dal pozzo.
      NOTA: Pozzi vuoti e vicini sono utili per depositare temporaneamente i rifiuti.
   3. Aggiungere delicatamente 200 μl 3,7% di formaldeide(tabella 1)lungo il lato del pozzo e ruotare la piastra per assicurarsi che i tessuti sezionati siano completamente sommersi.
   4. Riportare il piatto sul ghiaccio per 30 minuti. Se le ghiandole linfatiche esprimono proteine fluorescenti, tenere la piastra coperta per evitare il fotobleaching.
   5. Utilizzare una pipetta p200 per rimuovere con cura il fissatore.
   6. Lavare aggiungendo 200 μl 1x PBS al pozzo e posizionando la piastra su uno shaker orbitale per 5 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare una pipetta p200 per rimuovere con cura il PBS.
      NOTA: Le ghiandole linfatiche fisse possono essere lasciate sul ghiaccio in PBS fino a quando le ghiandole linfatiche per tutte le condizioni sperimentali non vengono sezionate e fissate.
   7. Ripetere i passaggi di lavaggio altre due volte.
   8. Aggiungere al pozzo una soluzione di permeabilizzazione da 200 μl (tabella1). Impostare la piastra su uno shaker orbitale per 45 minuti su RT.
      NOTA: 45 min è il "gold standard" per la permeabilizzazione della ghiandola linfatica ma gli autori hanno successo dopo soli 20 minuti.
   9. Rimuovere la soluzione con una pipetta p200.
   10. Diluire l'anticorpo primario con soluzioneanticorpale (tabella 1)secondo le specifiche del fornitore. Aggiungere 300 μl di soluzione di anticorpo primario al pozzo e assicurarsi che i tessuti sezionati siano completamente sommersi. Incubare a 4 °C durante la notte.
   11. Utilizzare una pipetta p200 per rimuovere l'anticorpo primario.
   12. Lavare aggiungendo 200 μl 1x PBS al pozzo e posizionando la piastra su uno shaker orbitale per 10 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare una pipetta p200 per rimuovere con cura il PBS.
   13. Ripetere i passaggi di lavaggio altre due volte.
   14. Diluire l'anticorpo secondario con la soluzione anticorpale secondo le specifiche del fornitore. Aggiungere 300 μl di soluzione di anticorpi secondari al pozzo e assicurarsi che i tessuti sezionati siano completamente sommersi. Incubare su uno shaker orbitale per almeno 2 ore a RT.
   15. Utilizzare una pipetta p200 per rimuovere l'anticorpo secondario e lavare come descritto nei passaggi 1.3.12 e 1.3.13. Non rimuovere il PBS dopo il lavaggio finale.
4. Montaggio ghiandola linfa
   1. Vetrine pulite con 70% di etanolo(tabella 1)e salviette tissutali.
   2. Per ogni condizione sperimentale, posizionare una goccia di tampone di montaggio(tabella 1)sullo scivolo di vetro.
      NOTA: Due condizioni si adattano a una diapositiva. Il volume del tampone di montaggio dipende dal numero di ghiandole linfatiche da montare. Utilizzare 2 μl per circa 18 - 20 ghiandole linfatiche, 1 μl per 10 - 12 e 0,5 μl per 5 o meno.
   3. Posizionare lo scivolo del microscopio su una base stereomicroscopica illuminata.
   4. Per un massimo di due condizioni alla volta, trasferire tutte le ghiandole linfatiche dal pozzo al tampone di montaggio con forcep, usando i ganci della bocca o il cordone nervoso ventrale come maniglia.
   5. Distanziare i tessuti sezionati in modo uniforme in forma circolare o rettangolare, diffondendo il tampone di montaggio nel processo.
   6. Per ciascuno dei tessuti sezionati, singolarmente, far scorrere una pinta delle pinie sotto il vaso dorsale e tirare delicatamente verso la periferia del tampone di montaggio.
      NOTA: Questo esegnerà la ghiandola linfaca dal resto dei tessuti sezionati e appiattirà la ghiandola linfatico sul vetro.
   7. Usando una pinta delle pinta e un movimento di segatura, tagliare il vaso dorsale tra la ghiandola linfatico e il cervello.
   8. Spostare il resto dei tessuti sezionati sul lato opposto della ghiandola linfatico, sul bordo più esterno del tampone.
      NOTA: I tessuti sezionati indesiderati alla fine formeranno un perimetro intorno alle ghiandole linfatiche e fungeranno da supporto su cui si baserà il copriletto.
   9. Ripetere fino a quando tutte le ghiandole linfatiche sono separate dai tessuti sezionati, riservando uno dei tessuti sezionati indesiderati da posizionare al centro.
   10. Prendi una coverlip tra due dita. Verificare che il coverslip sia privo di polvere e impronte digitali. Se necessario, utilizzare una salvietta tissutale e il 70% di etanolo per pulire il coverslip.
   11. Assicurandosi che il bordo del coverslip sia parallelo al bordo dello scivolo di vetro, abbassare con cura il coverslip sul tampone di montaggio.
       NOTA: Le diapositive al microscopio possono essere conservate a 4 °C prima dell'imaging. Il tempo massimo di conservazione dipende dalla stabilità degli anticorpi utilizzati. Le piastre a 24 pozzi possono essere risciacquate e riutilizzate.

2. Imaging

1. Immagine di emociti fissi e ghiandole linfatiche montate su un'appropriata fluorescenza standard o microscopio confocale a ingrandimento 20X o superiore secondo il manuale d'uso del produttore. Immagine di larve intere su uno stereomicroscopio standard con ingrandimento 2X secondo il manuale d'uso del produttore.
2. Seguire le istruzioni del fornitore di software per la deconvoluzione, se lo si desidera.

Representative Results

Figura 1: Melanizzazione in vivo delle cellule di cristallo. A) Le larve sono state posizionate singolarmente in tubi PCR prima del riscaldamento. Le frecce rosse indicano larve che non si trovano nella parte inferiore dei tubi. B) Un tipico modello di melanizzazione delle cellule cristalline dopo il riscaldamento, che a volte rivela la ghiandola linfaca (freccia; lato dorsale mostrato, la parte anteriore è lasciata). La barra di scala rappresenta 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immunoistochimica della ghiandola linfale larvale. A) Un'immagine DIC di una terza ghiandola linfale larvale instar che mostra il vaso dorsale (dv), i lobi primari (1°) e i lobi secondari (2°). La barra di scala rappresenta 100 μm. B) Una terza ghiandola linfale larvale instar rappresentativa da una larva che esprime geneticamente EBFP2 nella zona midollare e GFP nel centro di segnalazione posteriore. La ghiandola linfatico era macchiata da un anticorpo contro il dominio intracellulare notch (rosso). Immagine inalterata scattata con un microscopio a fluorescenza (in alto). La stessa immagine dopo la deconvoluzione (in basso). Le barre di scala rappresentano 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
microscope cover glass, 18 mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1