Overview
このビデオでは、ハエ幼虫の血腫の主要な部位である ショウジョウバエ リンパ腺について説明し、免疫組織化学と蛍光イメージングのために臓器を解剖して取り付けるプロトコルの例を示します。
Protocol
このプロトコルは、ライメルスとPflegerからの抜粋です, ショウジョウバエ ラルヴェのリンパ腺と血球を調べる方法, J. Vis. Exp. (2016).
1. ラーバルリンパ腺免疫染色
注: リンパ腺は、幼虫の前端から約3分の1の長さで、後側の脳のわずかに下に位置する。( 図 1Bの矢印を参照してください。リンパ腺は、後頭に横たわり、口のフックや脳に取り付けられた最も簡単に解剖されます。野生型, 第三のインスターリンパ腺は非常に小さな構造です;一次ローブの長さは約100~200μmです。( 図2A を参照してください)。
- このアッセイの発達段階とほぼ同じ幼虫を得るために、メスが2〜6時間の一定期間卵を産むことを許可することによって卵の採取を制限する。
- リンパ腺解離
- 実験条件ごとに、24ウェルプレートの1ウェルに1ml 1x PBS(表1)を加える。
- 使い捨て転送パイプを使用して、各ウェルに0.1%PBSTの1滴を加えます(表1)。
注: Tween 20などの洗剤を加えて表面張力を下げ、組織を井戸底に沈まさせる。 - プレートを氷の上に平らに置きます。
- 1x PBSで満たされた皿の井戸を解剖する幼虫を収集します。
- 照明付きの立体顕微鏡ベースにきれいな解剖パッドを置きます。使い捨て転送パイプを使用して、0.01% PBST の小さな滴をパッドに配置します(表 1)。1つの幼虫をPBSTドロップに移して解剖します。
- 幼虫を後端から約4分の1の長さの鉗子で持ち、後側を上に持ちます。
- 別の鉗子を使用して、幼虫を保持している鉗子の前にキューティクルをすぐにつかみます。口のフックが露出するまで、キューティクルを前端に向かってそっと引っ張ります。
注: 目的は、内部構造を乱すことなくキューティクルを剥がすることです。 - キューティクルを解放し、両方の鉗子を使用して幼虫を2にカットします。PBST ドロップから後端を取り外します。
注: キューティクルが口のフックまで剥がれていない場合は、幼虫を2本に切り、後端を取り除きます。1 組の鉗子を使用してキューティクルの端を保持し、もう一方の鉗子を使用して口のフックを開口部に押し込みます。これはキューティクルを反転し、口のフックを露出します。これは、代替解剖方法としても使用できます。 - 1 組の鉗子を使用して、安定性のためにキューティクル (腹側キューティクル、後部キューティクル フラップ、またはその両方) を固定します。
- 別の鉗子を使用して、露出した口のフックをつかみ、そっと引き出します。
注: これは、内部構造からキューティクルを分離します。理想的には、眼/触知機のイマジナルディスク、脳、リング腺、および後側の血管に隣接するリンパ腺が口のフックに取り付けられたままになります。 - 口のフックを保持しながら、唾液腺、脂肪体、腸などの不要な構造を慎重に除去します。
注: 脳が口のフックから分離した場合、リンパ腺はまだ脳に付着し、収集される可能性があります。この場合、口のフックの代わりに腹側神経コードを保持します。 - 口のフックまたは腹側神経コードをハンドルとして使用して、リンパ腺を含む解剖複合体を氷上の井戸に移す。 固定する前に30分を超えないようにしてください。
- 固定・免疫染色
- 24ウェルプレートを実体顕微鏡ベースに置きます。
- p200ピペットを使用して、PBSTを慎重に井戸から取り除きます。
注: 空の、隣接する井戸は一時的に廃棄物を堆積するのに有用である。 - 200 μl 3.7% ホルムアルデヒド (表 1)をウェルの側面にそっと加え、プレートを旋回して、解剖した組織が完全に水没するようにします。
- プレートを氷に30分間戻します。リンパ腺が蛍光タンパク質を発現する場合は、プレートを覆い、光の切開を防ぎます。
- p200ピペットを使用して、慎重に固定剤を取り除きます。
- ウェルに200 μl 1x PBSを加え、プレートを軌道シェーカーの上に5分間室温で置いて洗浄します。P200ピペットを使用してPBSを慎重に取り除きます。
注: すべての実験条件のリンパ腺が解剖され、固定されるまで、固定されたリンパ腺はPBSの氷の上に残すことができます。 - さらに2回、洗浄を繰り返します。
- ウェルに200μlのパーメアビライゼーション溶液(表1)を加えます。RTで45分間軌道シェーカーにプレートをセットします。
注:45 分はリンパ腺透過性の「ゴールドスタンダード」ですが、著者はわずか20分後に成功しています。 - p200ピペットで溶液を取り外します。
- 抗体溶液を用いて一次抗体を希釈する (表1)提供者の仕様に従う。300 μl の一次抗体溶液をウェルに加え、解剖した組織が完全に水没していることを確認します。一晩4°Cでインキュベートする。
- p200ピペットを使用して一次抗体を除去します。
- ウェルに200 μl 1x PBSを加え、プレートを軌道シェーカーの上に室温で10分間置いて洗浄します。P200ピペットを使用してPBSを慎重に取り除きます。
- さらに2回、洗浄を繰り返します。
- 提供者の仕様に従って抗体溶液を用いて二次抗体を希釈する。ウェルに300μlの二次抗体溶液を加え、解剖した組織が完全に水没していることを確認します。RTで少なくとも2時間軌道シェーカーでインキュベート。
- p200ピペットを使用して二次抗体を取り除き、ステップ1.3.12&1.3.13に記載されているように洗浄します。最終洗浄後にPBSを取り外さないで下してください。
- リンパ腺取り付け
- 70%エタノール(表1)と組織拭き取りを使用したクリーンガラス顕微鏡スライド。
- 実験条件ごとに、取り付けバッファーの1滴をガラススライドに置きます(表1)。
注: 2 つの条件は 1 つのスライドに収まります。取り付けバッファー容積は、取り付けるリンパ腺の数に依存する。約18~20個のリンパ腺に2μl、10~12の場合は1μl、5以下では0.5μlを使用してください。 - 照射された実体顕微鏡ベースの上に顕微鏡スライドを置きます。
- 一度に最大2つの条件については、口のフックまたは腹側神経コードをハンドルとして使用して、すべてのリンパ腺をウェルから鉗子付きの取り付けバッファに移します。
- 解剖した組織を円形または長方形の形で均等に配置し、その過程で取り付けバッファを広げます。
- 解剖された各組織について、個々に、後部容器の下で鉗子の1トンをスライドさせ、取り付けバッファーの周囲に向かって穏やかに引っ張る。
注: これは、解剖された組織の残りの部分からリンパ腺を引き出し、ガラス上のリンパ腺を平らにします。 - 鉗子の1トンと鋸の動きを使用して、リンパ腺と脳の間の後部血管を切断する。
- 解剖した組織の残りの部分をリンパ腺の反対側、バッファーの最も外側の端に移動します。
注: 望ましくない解剖された組織は、最終的にリンパ腺の周りに周囲を形成し、カバースリップが休むサポートとして機能します。 - すべてのリンパ腺が解剖された組織から分離されるまで繰り返し、不要な解剖された組織の1つを中央に置く。
- 2本の指の間にカバースリップを取る。カバースリップにほこりや指紋が含まれずであることを確認します。必要に応じて、ティッシュワイプと70%エタノールを使用してカバースリップを清掃します。
- カバースリップのエッジがガラススライドの端に平行であることを確認し、慎重にカバースリップを取り付けバッファの上に下げます。
注: 顕微鏡のスライドは、イメージングの前に4°Cで保存することができます。最大保存時間は、使用する抗体の安定性に依存します。24ウェルプレートはすすいで再利用できます。
2. イメージング
- 画像固定ヘモサイトと取り付けられたリンパ腺を、メーカーの操作マニュアルに従って20倍以上の倍率で適切な標準蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡に取り付けました。メーカーの操作マニュアルに従って2倍の標準的な実体顕微鏡上の全体の幼虫をイメージ。
- 必要に応じて、ソフトウェアプロバイダーのデコンボリューションの指示に従ってください。
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Representative Results
図1:インビボ結晶細胞メラナイゼーションA)幼虫を加熱前にPCRチューブに個別に入れた。赤い矢印は、チューブの底にはない幼虫を示しています。B)加熱後の典型的な結晶細胞のメラナイゼーションパターンで、リンパ腺を明らかにすることがある(矢印;後ろ側が示す、前子が残っている)。スケールバーは1 mmを表します。
図2:ラーバルリンパ腺免疫染色A)後回し血管(dv)、一次ローブ(1°)、二次ローブ(2°)を示す第3のインスター幼虫リンパ腺のDIC画像。スケールバーは100μmを表すB)後シグナルセンタの髄腔ゾーンおよびGFPで遺伝的に発現する幼虫から第三のインスター幼虫リンパ腺を表す。リンパ腺を、細胞内のノッチドメイン(赤)に対する抗体で染色した。蛍光顕微鏡で撮影した未変更画像(上)。デコンボリューション後の同じ画像(下)。スケールバーは20 μmを表します。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
Triton | Fisher | BP151-500 | |
Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
glycerol | VWR | EM-4750 | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
microscope cover glass, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
24-well plate | Corning | 351147 | |
disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |