Disección de la glándula linfática larvaria: Aislar el órgano productor de hemocitos de Drosophila

Overview

Este video describe la glándula linfática Drosophila —el sitio primario de la hematopoyesis en la larva de mosca— y muestra un protocolo de ejemplo para diseccionar y montar el órgano para la inmunohistoquímica y las imágenes fluorescentes.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Reimels y Pfleger, Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016).

1. Inmunohistoquímica de la glándula linfática larvaria

NOTA: La glándula linfática se encuentra aproximadamente a un tercio de longitud del extremo anterior de una larva ligeramente por debajo del cerebro en el lado dorsal. (Véase la flecha en la Figura 1B.) La glándula linfática flanquea el vaso dorsal y se disecciona más fácilmente unido a los ganchos bucales o al cerebro. Las glándulas linfáticas de tipo salvaje y tercera instar son estructuras muy pequeñas; los lóbulos primarios tienen aproximadamente 100 - 200 μm de longitud. (Véase la Figura 2A.)

1. Para obtener larvas de aproximadamente la misma etapa de desarrollo para este ensayo, restringir la recolección de huevos permitiendo a las hembras poner huevos durante un período de tiempo fijo de 2 a 6 horas.
2. Disección de la glándula linfática
   1. Para cada condición experimental, agregue 1 ml 1x PBS(Tabla 1)a un pozo de una placa de 24 pozos.
   2. Agregue 1 gota de 0,1% PBST(Tabla 1)a cada pozo utilizando un pipete de transferencia desechable.
      NOTA: El detergente, como Tween 20, se añade para reducir la tensión superficial, permitiendo que el tejido se hunda en la parte inferior del pozo.
   3. Coloque el plato plano sobre hielo.
   4. Recoger larvas en la disección de pozos de platos llenos de 1x PBS.
   5. Coloque una almohadilla de disección limpia sobre una base de estereomicroscopio iluminada. Utilice un pipete de transferencia desechable para colocar pequeñas gotas de 0,01% PBST(Tabla 1)en la almohadilla. Transfiera una larva a una gota pbst para su disección.
   6. Sostenga la larva con un par de fórceps de aproximadamente un cuarto de longitud desde el extremo posterior, lado dorsal hacia arriba.
   7. Usa otro par de fórceps para agarrar la cutícula inmediatamente anterior a los fórceps que sostienen la larva. Tire suavemente de la cutícula hacia el extremo anterior hasta que los ganchos de la boca estén expuestos.
      NOTA: El objetivo es pelar la cutícula sin perturbar ninguna estructura interna.
   8. Suelte la cutícula y use ambos fórceps para cortar la larva en dos. Quite el extremo posterior de la caída pbst.
      NOTA: Si la cutícula no se pela hasta los ganchos de la boca, corte la larva en dos y retire el extremo posterior. Utilice un par de fórceps para sostener el borde de la cutícula, y utilice el otro par de fórceps para empujar los ganchos de la boca a través de la abertura. Esto invertirá la cutícula y expondrá los ganchos de la boca. Esto también se puede utilizar como un método de disección alternativo.
   9. Utilice un par de fórceps para fijar la cutícula (ya sea la cutícula ventral, la solapa de cutícula dorsal o ambas) para la estabilidad.
   10. Usa otro par de fórceps para agarrar los ganchos de boca expuestos y sacarlos suavemente.
       NOTA: Esto separará la cutícula de las estructuras internas. Idealmente, los discos imaginales oculares/antenales, el cerebro, la glándula tórica y la glándula linfática que flanquean el vaso dorsal permanecerán unidos a los ganchos bucales.
   11. Mientras todavía sostiene los ganchos de la boca, retire cuidadosamente las estructuras no deseadas como las glándulas salivales, el cuerpo de grasa y el intestino.
       NOTA: Si el cerebro se separa de los ganchos bucales, la glándula linfática todavía podría estar unida y recogida con el cerebro. En este caso, sostenga el cordón nervioso ventral en lugar de los ganchos bucales.
   12. Usando los ganchos bucales o el cordón nervioso ventral como mango, transfiera el complejo diseccionado que contiene la glándula linfática al pozo sobre hielo. No exceda de 30 minutos antes de la fijación.
3. Fijación e inmunohistoquímica
   1. Coloque la placa de 24 pozos en la base del estereomicroscopio.
   2. Utilice una pipeta p200 para extraer cuidadosamente el PBST del pozo.
      NOTA: Vacíos, los pozos vecinos son útiles para depositar temporalmente los residuos.
   3. Agregue suavemente 200 μl 3.7% formaldehído(Tabla 1)por el lado del pozo y arremolina la placa para asegurarse de que los tejidos diseccionados estén completamente sumergidos.
   4. Vuelva a congelar el plato durante 30 minutos. Si las glándulas linfáticas expresan proteínas fluorescentes, mantenga la placa cubierta para evitar el fotobleaching.
   5. Utilice una pipeta p200 para quitar cuidadosamente el fijador.
   6. Lavar añadiendo 200 μl 1x PBS al pozo y colocando la placa en una coctelera orbital durante 5 minutos a temperatura ambiente. Utilice una pipeta p200 para quitar cuidadosamente el PBS.
      NOTA: Las glándulas linfáticas fijas se pueden dejar en el hielo en PBS hasta que las glándulas linfáticas para todas las condiciones experimentales se diseccionen y arreglen.
   7. Repita los pasos de lavado dos veces más.
   8. Añadir 200 μl de solución de permeabilización(Tabla 1)al pozo. Ajuste la placa en una coctelera orbital durante 45 minutos en RT.
      NOTA: 45 min es el "estándar de oro" para la permeabilización de la glándula linfática, pero los autores tienen éxito después de sólo 20 min.
   9. Retire la solución con una pipeta p200.
   10. Diluir anticuerpo primario con solución de anticuerpos (Tabla 1) de acuerdo con las especificaciones del proveedor. Agregue 300 μl de solución de anticuerpos primarios al pozo y asegúrese de que los tejidos diseccionados estén completamente sumergidos. Incubar a 4 °C durante la noche.
   11. Utilice una pipeta p200 para eliminar el anticuerpo primario.
   12. Lavar añadiendo 200 μl 1x PBS al pozo y colocando la placa en una coctelera orbital durante 10 minutos a temperatura ambiente. Utilice una pipeta p200 para quitar cuidadosamente el PBS.
   13. Repita los pasos de lavado dos veces más.
   14. Diluir anticuerpo secundario con solución de anticuerpos de acuerdo con las especificaciones del proveedor. Agregue 300 μl de solución secundaria de anticuerpos al pozo y asegúrese de que los tejidos diseccionados estén completamente sumergidos. Incubar en un agitador orbital durante al menos 2 horas en RT.
   15. Utilice una pipeta p200 para eliminar el anticuerpo secundario y lavar como se describe en los pasos 1.3.12 y 1.3.13. No retire el PBS después del lavado final.
4. Montaje de la glándula linfática
   1. El microscopio de vidrio limpio se desliza usando 70% etanol(Tabla 1)y toallitas de tejido.
   2. Para cada condición experimental, coloque una gota de búfer de montaje(Tabla 1)en la corredera de vidrio.
      NOTA: Dos condiciones encajan en una diapositiva. El volumen del búfer de montaje depende del número de glándulas linfáticas que se monten. Utilice 2 μl para aproximadamente 18 - 20 glándulas linfáticas, 1 μl para 10 - 12, y 0.5 μl para 5 o menos.
   3. Coloque la diapositiva del microscopio sobre una base de estereomicroscopio iluminada.
   4. Para hasta dos condiciones a la vez, transfiera todas las glándulas linfáticas del pozo al búfer de montaje con fórceps, utilizando los ganchos bucales o el cordón nervioso ventral como mango.
   5. Espaciar los tejidos diseccionados uniformemente en forma circular o rectangular, extendiendo el búfer de montaje en el proceso.
   6. Para cada uno de los tejidos diseccionados, individualmente, deslice una pinza de los fórceps debajo del recipiente dorsal y tire suavemente hacia la periferia del búfer de montaje.
      NOTA: Esto sacará la glándula linfática del resto de los tejidos diseccionados y aplanará la glándula linfática en el vidrio.
   7. Usando una tong de los fórceps y un movimiento de aserrado, corta el vaso dorsal entre la glándula linfática y el cerebro.
   8. Mueva el resto de los tejidos diseccionados al lado opuesto de la glándula linfática, en el borde más externo del tampón.
      NOTA: Los tejidos diseccionados no deseados eventualmente formarán un perímetro alrededor de las glándulas linfáticas y servirán como soporte sobre el cual descansará el cubrecabecas.
   9. Repita hasta que todas las glándulas linfáticas estén separadas de los tejidos diseccionados, reservando uno de los tejidos diseccionados no deseados para colocar en el centro.
   10. Tome un punto de cubierta entre dos dedos. Compruebe que el control de cubiertas esté libre de polvo y huellas dactilares. Si es necesario, utilice una toallita de tejido y un 70% de etanol para limpiar la cubierta.
   11. Asegurándose de que el borde de la cubierta es paralelo al borde de la diapositiva de vidrio, baje cuidadosamente la cubierta sobre el búfer de montaje.
       NOTA: Las diapositivas del microscopio se pueden almacenar a 4 °C antes de la toma de imágenes. El tiempo máximo de almacenamiento depende de la estabilidad de los anticuerpos utilizados. Las placas de 24 pozos se pueden enjuagar y reutilizar.

2. Imágenes

1. Imagen de hemocitos fijos y glándulas linfáticas montadas en un microscopio confocal o fluorescencia estándar apropiado a 20X o mayor aumento según el manual de funcionamiento del fabricante. Imagen de larvas enteras en un estereomicroscopio estándar a una ampliación de 2X según el manual de funcionamiento del fabricante.
2. Siga las instrucciones del proveedor de software para la devolución, si lo desea.

Representative Results

Figura 1: Melanización de celda de cristal vivo. A) Las larvas se colocaron individualmente en tubos PCR antes del calentamiento. Las flechas rojas indican larvas que no están en la parte inferior de los tubos. B) Un patrón típico de melanización de células cristalinas después del calentamiento, que a veces revela la glándula linfática (flecha; lado dorsal mostrado, anterior se deja). Barra de escala representa 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Inmunohistoquímica de la glándula linfática larvaria. A) Una imagen DIC de una tercera glándula linfática larvaria instar que muestra el vaso dorsal (dv), lóbulos primarios (1°) y lóbulos secundarios (2°). Barra de escala representa 100 μm. B) Una tercera glándula linfática larvaria representativa de una larva que expresa genéticamente EBFP2 en la zona medular y GFP en el centro de señalización posterior. La glándula linfática estaba manchada con un anticuerpo contra el dominio intracelular de Muesca (rojo). Imagen inalterada tomada con un microscopio de fluorescencia (arriba). La misma imagen después de la devolución (abajo). Las barras de escala representan 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
microscope cover glass, 18 mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1