Larvlymfkörtel dissekering: Isolerar det Drosophila Hemocyte-producerande organet

Overview

Den här videon beskriver Drosophila lymfkörtel - den primära platsen för hematopoiesis i fluglarven - och visar ett exempelprotokoll för att dissekera och montera organet för immunohistokemi och fluorescerande avbildning.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Reimels och Pfleger, Metoder för att undersöka lymfkörteln och hemocyterna i Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016).

1. Larv lymfkörtel immunohistokemi

OBS: Lymfkörteln ligger ungefär en tredjedels längd från den främre änden av en larva något under hjärnan på dorsalsidan. (Se pilen i figur 1B.) Lymfkörteln flankerar dorsalkärlet och dissekeras lättast fäst vid munkrokarna eller hjärnan. Wild-typ, tredje instar lymfkörtlar är mycket små strukturer; de primära loberna är ungefär 100- 200 μm långa. (Se figur 2a.)

1. För att få larver av ungefär samma utvecklingsstadium för denna analys, begränsa äggsamlingen genom att tillåta kvinnor att lägga ägg under en fast tidsperiod på 2- 6 timmar.
2. Dissekering av lymfkörtlar
   1. För varje experimentellt tillstånd, tillsätt 1 ml 1x PBS(tabell 1)till en brunn på en 24-brunnsplatta.
   2. Tillsätt 1 droppe 0,1 % PBST (tabell 1) till varje brunn med hjälp av ett engångsöverföringsrör.
      OBS: Tvättmedel, såsom Tween 20, tillsätts för att sänka ytspänningen, så att vävnaden kan sjunka till botten av brunnen.
   3. Lägg tallriken platt på is.
   4. Samla larver i dissekerande diskbrunnar fyllda med 1x PBS.
   5. Placera en ren dissekeringsplatta på en upplyst stereomikroskopbas. Använd ett engångsöverföringsrör för att placera små droppar på 0,01 % PBST(tabell 1)på dynan. Överför en larva till en PBST-droppe för dissekering.
   6. Håll larven med ett par tång ungefär en fjärdedels längd från den bakre änden, dorsala sidan upp.
   7. Använd ett annat par tång för att ta tag i nagelbandet omedelbart främre till tången som håller larven. Dra försiktigt nagelbandet mot den främre änden tills munkrokarna är exponerade.
      OBS: Syftet är att skala nagelbandet utan att störa några inre strukturer.
   8. Släpp nagelbandet och använd båda tångarna för att skära larven i två. Ta bort den bakre änden från PBST-droppen.
      OBS: Om nagelbandet inte skalar hela vägen till munkrokarna, skär larven i två och ta bort den bakre änden. Använd ett par tångar för att hålla i nagelbandets kant och använd det andra tångparet för att trycka munkrokarna genom öppningen. Detta kommer att invertera nagelbandet och exponera munkrokarna. Detta kan också användas som en alternativ dissekeringsmetod.
   9. Använd ett par tångar för att fästa nagelbandet (antingen ventral nagelband, dorsal nagelbandsklaffen eller båda) för stabilitet.
   10. Använd ytterligare ett par tångar för att ta tag i de exponerade munkrokarna och dra försiktigt ut dem.
       OBS: Detta kommer att skilja nagelbandet från de inre strukturerna. Helst kommer ögon-/antenn-imaginala skivor, hjärna, ringkörtel och lymfkörtel som flankerar dorsalkärlet att förbli fästa vid munkrokarna.
   11. Medan du fortfarande håller i munkrokarna, ta försiktigt bort oönskade strukturer som salivkörtlarna, fettkroppen och tarmarna.
       OBS: Om hjärnan separerar från munkrokarna kan lymfkörteln fortfarande fästas på och samlas in med hjärnan. I det här fallet, håll ventral nervkabeln istället för munkrokarna.
   12. Använd munkrokarna eller ventrala nervsladden som handtag, överför det dissekerade komplexet som innehåller lymfkörteln till brunnen på is. Överskrid inte 30 min före fixering.
3. Fixering och immunohistokemi
   1. Placera 24-brunnsplattan på stereomikroskopbasen.
   2. Använd en p200-pipett för att försiktigt ta bort PBST från brunnen.
      OBS: Tomma, närliggande brunnar är användbara för att tillfälligt deponera avfall.
   3. Tillsätt försiktigt 200 μl 3,7% formaldehyd(tabell 1)längs sidan av brunnen och snurra plattan för att säkerställa att de dissekerade vävnaderna är helt nedsänkta.
   4. Sätt tillbaka plattan på is i 30 minuter. Om lymfkörtlarna uttrycker fluorescerande protein(ar), håll plattan täckt för att förhindra fotoblekning.
   5. Använd en p200-pipett för att försiktigt ta bort fixeringen.
   6. Tvätta genom att tillsätta 200 μl 1x PBS till brunnen och placera plattan på en orbital shaker i 5 minuter vid rumstemperatur. Använd en p200-pipett för att försiktigt ta bort PBS.
      OBS: Fasta lymfkörtlar kan lämnas på is i PBS tills lymfkörtlar för alla experimentella tillstånd dissekeras och fixeras.
   7. Upprepa tvättstegen två gånger till.
   8. Tillsätt 200 μl permeabiliseringslösning (tabell 1) till brunnen. Ställ plattan på en orbital shaker i 45 min på RT.
      OBS: 45 min är "guldstandarden" för lymfkörtelpermeabilisering men författarna har framgång efter bara 20 min.
   9. Ta bort lösningen med en p200-pipett.
   10. Späd ut primär antikroppen med antikroppslösning (tabell 1) enligt leverantörens specifikationer. Tillsätt 300 μl primär antikroppslösning till brunnen och se till att de dissekerade vävnaderna är helt nedsänkta. Inkubera vid 4 °C över natten.
   11. Använd en p200-pipett för att ta bort den primära antikroppen.
   12. Tvätta genom att tillsätta 200 μl 1x PBS till brunnen och placera plattan på en orbital shaker i 10 min vid rumstemperatur. Använd en p200-pipett för att försiktigt ta bort PBS.
   13. Upprepa tvättstegen två gånger till.
   14. Späd ut sekundär antikropp med antikroppslösning enligt leverantörens specifikationer. Tillsätt 300 μl sekundär antikroppslösning till brunnen och se till att de dissekerade vävnaderna är helt nedsänkta. Inkubera på en orbital shaker i minst 2 timmar på RT.
   15. Använd en p200-pipett för att avlägsna den sekundära antikroppen och tvätta enligt beskrivningen i steg 1.3.12 och 1.3.13. Ta inte bort PBS efter sluttvätten.
4. Montering av lymfkörtlar
   1. Rena glasmikroskop glider med 70% etanol(tabell 1)och vävnadsservetter.
   2. För varje experimentellt tillstånd, placera en droppe monteringsbuffert (tabell 1) på glasrutschbanan.
      OBS: Två förhållanden passar på en bild. Monteringsbuffertvolymen beror på antalet lymfkörtlar som ska monteras. Använd 2 μl för cirka 18- 20 lymfkörtlar, 1 μl för 10 - 12 och 0,5 μl för 5 eller mindre.
   3. Placera mikroskopbilden på en upplyst stereomikroskopbas.
   4. För upp till två förhållanden i taget, överför alla lymfkörtlar från brunnen till monteringsbufferten med tång, med hjälp av munkrokarna eller ventral nervkabel som handtag.
   5. Sprid de dissekerade vävnaderna jämnt i en cirkulär eller rektangulär form och sprid monteringsbufferten i processen.
   6. För var och en av de dissekerade vävnaderna, individuellt, skjut en tång av tången under dorsalkärlet och dra försiktigt mot monteringsbuffertens periferi.
      OBS: Detta kommer att dra lymfkörteln ut från resten av de dissekerade vävnaderna och platta lymfkörteln på glaset.
   7. Använd en tång av tången och en sågrörelse, skär dorsalkärlet mellan lymfkörteln och hjärnan.
   8. Flytta resten av de dissekerade vävnaderna till motsatt sida av lymfkörteln, vid buffertens yttersta kant.
      OBS: De oönskade dissekerade vävnaderna kommer så småningom att bilda en omkrets runt lymfkörtlarna och fungera som ett stöd på vilket täckglaset kommer att vila.
   9. Upprepa tills alla lymfkörtlar är separerade från de dissekerade vävnaderna och reservera en av de oönskade dissekerade vävnaderna att placera i mitten.
   10. Ta ett täckslip mellan två fingrar. Kontrollera att täcket är fritt från damm och fingeravtryck. Använd vid behov en vävnadsservett och 70% etanol för att rengöra täckglaset.
   11. Se till att överdragskanten är parallell med glasets kant, sänk försiktigt täcket över monteringsbufferten.
       OBS: Mikroskopbilder kan förvaras vid 4 °C före avbildning. Maximal lagringstid beror på stabiliteten hos de antikroppar som används. 24-brunnsplattor kan sköljas och återanvändas.

2. Bildbehandling

1. Bild fasta hemocyter och monterade lymfkörtlar på ett lämpligt standard fluorescens- eller konfokalt mikroskop vid 20X eller högre förstoring enligt tillverkarens bruksanvisning. Avbilda hela larver på ett standard stereomikroskop vid 2X förstoring enligt tillverkarens bruksanvisning.
2. Följ programvaruleverantörens instruktioner för dekonvolution om så önskas.

Representative Results

Figur 1: In Vivo Crystal Cell Melanization. A) Larver placerades individuellt i PCR-rör före uppvärmning. Röda pilar indikerar larver som inte är i botten av rören. B) Ett typiskt kristallcellsmantaniseringsmönster efter uppvärmning, som ibland avslöjar lymfkörteln (pil; dorsal sida visas, främre är vänster). Skalstrecket representerar 1 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 2: Larvlymfkörtelimmunhistokemi. A) En DIC-bild av en tredje instar larv lymfkörtel som visar dorsalkärlet (dv), primära lober (1°) och sekundära lober (2°). Skalstång representerar 100 μm. B) En representativ tredje instar larv lymfkörtel från en larva genetiskt uttrycker EBFP2 i medullary zonen och GFP i bakre signalering centrum. Lymfkörteln var fläckad med en antikropp mot notch intracellulära domänen (röd). Oförändrad bild tagen med ett fluorescensmikroskop (överst). Samma bild efter dekonvolution (nederkant). Skalstänger representerar 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
microscope cover glass, 18 mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1