Overview
ويحيط الجنين Drosophila من قبل الأغشية الخارجية واقية. للوصول إلى الجنين ، غالبا ما تتم إزالة الكوريون - الأبعد من الأغشية. يصف هذا الفيديو طريقة شائعة الاستخدام للتخلص من المشيمة باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم. يوضح البروتوكول المثال الإجراء أثناء استخدام التقنيات العقيمة اللازمة لتربية الحيوانات المحورية أو الغنوتوبيوتية.
Protocol
هذا البروتوكول هو مقتطف من كويل وآخرون.، تربية ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster تحت شروط أكسينيك والغنوتوبيوتك، J. Vis. Exp. (2016).
1. إعداد أقفاص وضع البيض
- جعل عصير العنب أجار لوحات عن طريق microwaving 100 مل من الماء، 10 غرام خميرة البيرة، 10 غرام الجلوكوز، و 1 غرام من أجار. يغلى 3 مرات في الخطوة 1.1 ويضاف 10 غرام من عصير العنب المجمد للتركيز لزيادة رؤية البيض على طبق أغار.
- عندما يبرد أغار إلى 55 درجة مئوية، صب 20 مل في أطباق بيتري 100 ملم والسماح لترسيخ.
- تغطية سطح لوحات أجار مع عجينة الخميرة عن طريق خلط الخميرة البيرة 1 غرام مع 15 غرام من الماء. صب عجينة الخميرة على لوحة أجار التأكد من تغطية السطح، ثم صب قبالة الزائدة، وترك بقايا الخميرة رقيقة وراء. إذا تم استخدام لوحات متعددة، يمكن صب لصق بشكل تسلسلي إلى لوحات متعددة.
- نقل لوحات أجار في الجزء السفلي من القفص.
ملاحظة: حاوية ديلي 32 أوقية هو بديل جيد لأقفاص ذبابة الاكريليك.- جعل أغطية لحاويات ديلي 32 أوقية عن طريق قطع حفرة في الجزء العلوي ولصق شبكة تنفس على الحفرة مع الغراء غير سامة. إذا كان الغراء قابل للذوبان في الماء منع التعرض للمياه إلى الغطاء.
- نقل 200-300 الذباب في الحاوية وتغطية مع غطاء. قم بتغطية الثقب المحمي بشبكة بغطاء طبق بيتري فارغ لمنع التبخر من سطح أجار وإضافة ورقة أنسجة رطبة داخل الغطاء إذا رغبت في ذلك. حضانة الذباب في 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها لمدة 16-20 ساعة.
2. جمع البيض
- إعداد منخل لجمع البيض عن طريق وضع شبكة النايلون في الشجيرات البلاستيكية.
- لاسترداد لوحة مع البيض على ذلك، وإزالة الذباب من القفص عن طريق نقل إلى حاوية فارغة. إذا كان سيتم استخدام الذباب نفسه في اليوم التالي، نقل على الفور إلى قفص جديد يحتوي على طبق عصير العنب الطازج أجار. يمكن استخدام الذباب لمدة 3-5 أيام متتالية
- إزالة الذباب الميت من أجار مع فرشاة نظيفة، مع الحرص على عدم تفريق أجار.
- جمع البيض عن طريق شطف لوحة أجار مع الماء المقطر، بالفرشاة بلطف البيض من سطح أجار، وصب الطين على شبكة. كرر 3-4 مرات حتى تتم إزالة كل أو معظم البيض من لوحة أجار.
3. ديكوريونات البيض ونقلها إلى النظام الغذائي المعقم
- إعداد خزانة السلامة البيولوجية عن طريق رش الداخل (بما في ذلك الجانبين) مع الإيثانول 70٪. مسح الجزء السفلي مع نسيج المختبر، وتعقيم غطاء محرك السيارة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية ل ~ 15 دقيقة. تعقيم جميع الإمدادات غير البيولوجية (أكواب العينات ، فرشاة الطلاء ، ملقط ، حاوية النفايات ، 400 مل من الماء المعقم ، و 100 مل من هيبوكلوريت الصوديوم 0.6٪ ) عن طريق الرش بالإيثانول ووضعه على الفور في خزانة السلامة الحيوية. تعقيم مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
- بدء أول من 2 هيبوكلوريت الصوديوم يغسل عن طريق وضع الشجيرات مع البيض في كوب عينة 120 مل أو حاوية معقمة أخرى. صب ببطء ~ 90 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 0.6٪ في الأدغال حتى أسفل الحافة.
- شطف البيض لمدة 2.5 دقيقة. دوريا إعادة تعليق البيض باستخدام ملقط لتحريك الشجيرات صعودا وهبوطا في محلول هيبوكلوريت.
- نقل الأدغال مباشرة إلى كوب عينة الثانية، مليئة مسبقا مع 90 مل التبييض، داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
- كرر الخطوة 3.3 داخل خزانة السلامة البيولوجية. في نهاية علاج التبييض الثاني ، يجب أن يبدأ البيض في الالتزام بجوانب الأدغال.
- تنفيذ الخطوات 3.7-3.8 في خزانة السلامة البيولوجية.
- تجاهل التبييض وغسل الشجيرات بالماء العقيم 3 مرات. إعادة تعليق البيض عدة مرات خلال كل غسل عن طريق تحريك الشجيرات مع ملقط. بحلول نهاية الغسيل الثالث يجب إرفاق معظم البيض إلى جانب الأدغال.
- باستخدام فرشاة الطلاء المعقمة في الإيثانول، نقل البيض من جانب الأدغال إلى النظام الغذائي العقيم. نقل البيض بشكل فردي أو على دفعات صغيرة. تهدف إلى 30-50 بيضة لكل قارورة. اترك القبعات فضفاضة للسماح للأوكسجين بدخول الأنبوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
