Overview
Het Drosophila embryo is omgeven door beschermende buitenste membranen. Om toegang te krijgen tot het embryo wordt het koraal – de buitenste van de membranen – vaak verwijderd. Deze video beschrijft een veelgebruikte methode van dechorionatie met natriumhypochloriet. Het voorbeeldprotocol demonstreert de procedure met behulp van steriele technieken die nodig zijn voor de bijl- of gnotobiotische veeteelt.
Protocol
Dit protocol is een fragment uit Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).
1. Bereid eierlegkooien voor
- Maak druivensap agar borden door microwaving 100 ml water, 10 g biergist, 10 g glucose en 1 g agar. Breng 3 keer aan de kook in stap 1.1 en voeg 10 g bevroren druivensapconcentraat toe om de zichtbaarheid van eieren op de agarplaat te vergroten.
- Wanneer agar is afgekoeld tot 55 °C, giet 20 ml in 100 mm Petrischalen en laat stollen.
- Bedek het oppervlak van de agarplaten met een gistpasta door 1 g biergist te mengen met 15 g water. Giet gistpasta op de agarplaat en zorg ervoor dat het oppervlak bedekt is en giet vervolgens het overtollige af, waardoor een dun gistresidu achterblijft. Als er meerdere platen worden gebruikt, kan de pasta opeenvolgend op meerdere platen worden gegoten.
- Breng agarplaten over in de bodem van een kooi.
OPMERKING: Een 32 oz deli container is een goede vervanger voor acryl vlieg kooien.- Maak deksels voor 32 oz deli containers door een gat in de bovenkant te snijden en een ademend gaas over het gat te lijmen met niet-giftige lijm. Als de lijm in water oplosbaar is, voorkom dan blootstelling van water aan het deksel.
- Breng 200-300 vliegen in de container en dek af met deksel. Bedek het met gaas beschermde gat met een leeg petrischaaldeksel om verdamping van het agaroppervlak te voorkomen en voeg indien gewenst een vochtig tissuepapier toe aan het deksel. Incubeer vliegt 's nachts bij 25 °C gedurende 16-20 uur.
2. Verzamel eieren
- Bereid een zeef voor het verzamelen van eieren door nylon gaas in een plastic bus te plaatsen.
- Om de plaat met eieren erop op te halen, verwijdert u vliegen uit de kooi door over te brengen naar een lege container. Als dezelfde vliegen de volgende dag worden gebruikt, breng dan onmiddellijk over naar een nieuwe kooi met een vers gegiste druivensap-agarplaat. Vliegen kunnen worden gebruikt voor 3-5 opeenvolgende dagen
- Verwijder dode vliegen van de agar met een schone kwast en wees voorzichtig om de agar niet te breken.
- Verzamel eieren door de agarplaat met gedestilleerd water te spoelen, eieren voorzichtig van het agaroppervlak te borstelen en de drijfmest over het gaas te gieten. Herhaal dit 3-4 keer totdat alle of de meeste eieren van de agarplaat zijn verwijderd.
3. Dechorionaateieren en overdracht naar steriel dieet
- Bereid de bioveiligheidskast voor door de binnenkant (inclusief zijkanten) te besproeien met 70% ethanol. Veeg de bodem af met een laboratoriumweefsel en steriliseer de kap gedurende ~ 15 minuten met UV-licht. Steriliseer alle niet-biologische benodigdheden (monsterbekers, penseel, tang, afvalcontainer, 400 ml gesteriliseerd water en 100 ml 0,6% natriumhypochloriet) door te spuiten met ethanol en onmiddellijk in de bioveiligheidskast te plaatsen. Steriliseer met UV-licht gedurende 15 minuten.
- Begin de eerste van 2 natriumhypochlorietwassingen door de bus met de eieren in een monsterbeker van 120 ml of een andere steriele container te plaatsen. Giet langzaam ~90 ml 0,6% natriumhypochlorietoplossing in de bus tot net onder de rand.
- Spoel de eieren 2,5 min. Hang de eieren regelmatig opnieuw op met behulp van een tang om de bus op en neer te bewegen in de hypochlorietoplossing.
- Breng de bus rechtstreeks over in een tweede monsterbeker, voorgevuld met 90 ml bleekmiddel, in de bioveiligheidskast.
- Herhaal stap 3.3 in de bioveiligheidskast. Aan het einde van de tweede bleekbehandeling moeten de eieren zich aan de zijkanten van de bus beginnen te hechten.
- Voer de stappen 3.7-3.8 uit in de bioveiligheidskast.
- Gooi het bleekmiddel weg en was de bus 3 keer met steriel water. Hang de eieren tijdens elke wasbeurt meerdere keren opnieuw op door de bus met een tang te verplaatsen. Tegen het einde van de derde wasbeurt moeten de meeste eieren aan de zijkant van de bus worden bevestigd.
- Breng met behulp van een penseel gesteriliseerd in ethanol eieren over van de zijkant van de bus naar het steriele dieet. Breng eieren afzonderlijk of in kleine batches over. Streef naar 30-50 eieren per flacon. Laat de doppen los zodat er zuurstof in de buis kan komen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
