Overview
L’embryon de Drosophila est entouré de membranes externes protectrices. Pour avoir accès à l’embryon, le chorion, le plus externe des membranes, est souvent enlevé. Cette vidéo décrit une méthode couramment utilisée de déchorionation à l’aide de l’hypochlorite de sodium. Le protocole d’exemple démontre la procédure tout en employant les techniques stériles nécessaires pour l’élevage d’animaux axeniques ou gnotobiotic.
Protocol
Ce protocole est un extrait de Koyle et coll.,Élevage de la mouche des fruits Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).
1. Préparer des cages de ponte
- Faire des assiettes d’agar à jus de raisin en micro-ondes de 100 ml d’eau, 10 g de levure de bière, 10 g de glucose et 1 g d’agar. Porter à ébullition 3 fois à l’étape 1.1 et ajouter 10 g de concentré de jus de raisin congelé pour augmenter la visibilité des œufs sur la plaque d’agar.
- Lorsque l’agar a refroidi à 55 °C, verser 20 ml dans des boîtes de Pétri de 100 mm et laisser solidifier.
- Couvrir la surface des assiettes d’agar d’une pâte de levure en mélangeant 1 g de levure de bière avec 15 g d’eau. Verser la pâte de levure sur la plaque d’agar en s’assurant que la surface est couverte, puis verser l’excès, laissant un mince résidu de levure derrière. Si plusieurs plaques sont utilisées, la pâte peut être versée séquentiellement dans plusieurs assiettes.
- Transférer les plaques d’agar dans le fond d’une cage.
REMARQUE: Un récipient de charcuterie de 32 oz est un bon substitut pour les cages à mouches acryliques.- Faire des couvercles pour des contenants de charcuterie de 32 oz en coupant un trou dans le haut et en collant un maillage respirant au-dessus du trou avec de la colle non toxique. Si la colle est soluble dans l’eau empêcher l’exposition à l’eau au couvercle.
- Transférer 200-300 mouches dans le récipient et couvrir avec couvercle. Couvrir le trou protégé par le maillage d’un couvercle vide de boîte de Pétri pour éviter l’évaporation de la surface de l’agar et ajouter un papier de soie humide à l’intérieur du couvercle si désiré. L’incubation vole à 25 °C pendant la nuit pendant 16-20 heures.
2. Recueillir des œufs
- Préparer un tamis pour la collecte des œufs en plaçant le maillage en nylon dans un buisson en plastique.
- Pour récupérer la plaque avec des œufs dessus, retirez les mouches de la cage en les transférant dans un contenant vide. Si les mêmes mouches seront utilisées le lendemain, transférer immédiatement dans une nouvelle cage contenant une assiette d’agar de jus de raisin fraîchement levure. Les mouches peuvent être utilisées pendant 3-5 jours séquentiels
- Retirez les mouches mortes de l’agar à l’aide d’un pinceau propre, en prenant soin de ne pas briser l’agar.
- Recueillir les œufs en rinçant la plaque d’agar avec de l’eau distillée, en brossant doucement les œufs de la surface de l’agar et en versant le lisier sur le maillage. Répéter 3 à 4 fois jusqu’à ce que tous les œufs ou la plupart des œufs aient été retirés de la plaque d’agar.
3. Oeufs de déchorionate et transfert à la diète stérile
- Préparer l’armoire de biosécurité en pulvérisant l’intérieur (y compris les côtés) avec 70% d’éthanol. Essuyer le fond avec un tissu de laboratoire, et stériliser le capot avec de la lumière UV pendant ~ 15 min. Stériliser tous les approvisionnements non biologiques (tasses à spécimens, pinceau, forceps, conteneur à déchets, eau stérilisée de 400 ml et 100 ml d’hypochlorite de sodium à 0,6 %) en pulvérisant de l’éthanol et en les plaçant immédiatement dans l’armoire de biosécurité. Stériliser avec la lumière UV pendant 15 min.
- Commencez le premier des 2 lavages d’hypochlorite de sodium en plaçant le buisson avec les oeufs dans une tasse de spécimen de 120 ml ou un autre récipient stérile. Versez lentement ~90 ml de solution hypochlorite de sodium de 0,6 % dans le buisson jusqu’à ce qu’il soit juste en dessous de la jante.
- Rincer les œufs pendant 2,5 minutes. Suspendre périodiquement les œufs en utilisant des forceps pour déplacer le buisson de haut en bas dans la solution hypochlorite.
- Transférer le buisson directement dans une deuxième tasse de spécimen, pré-rempli de 90 ml d’eau de Javel, à l’intérieur de l’armoire de biosécurité.
- Répétez l’étape 3.3 à l’intérieur de l’armoire de biosécurité. À la fin du deuxième traitement à l’eau de Javel, les œufs devraient commencer à adhérer aux côtés du buisson.
- Effectuez les étapes 3.7-3.8 dans le cabinet de biosécurité.
- Jeter l’eau de Javel et laver le buisson avec de l’eau stérile 3 fois. Suspendre à nouveau les œufs plusieurs fois au cours de chaque lavage en déplaçant le buisson avec des forceps. À la fin du troisième lavage, la plupart des œufs doivent être fixés sur le côté du buisson.
- À l’aide d’un pinceau stérilisé à l’éthanol, transférer les œufs du côté du buisson au régime stérile. Transférer les œufs individuellement ou en petits lots. Visez 30-50 oeufs par flacon. Laissez les bouchons lâches pour permettre à l’oxygène d’entrer dans le tube.
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