Overview
Der Drosophila-Embryo ist von schützenden äußeren Membranen umgeben. Um Zugang zum Embryo zu erhalten, wird oft der Chorion – die äußerste der Membranen – entfernt. Dieses Video beschreibt eine häufig verwendete Methode der Dechorionation mit Natriumhypochlorit. Das Beispielprotokoll demonstriert das Verfahren unter Verwendung steriler Techniken, die für die axtische oder gnotobiotische Tierhaltung erforderlich sind.
Protocol
Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).
1. Bereiten Sie Eierlegende Käfige vor
- Machen Sie Traubensaft-Agar-Platten, indem Sie 100 ml Wasser, 10 g Bierhefe, 10 g Glukose und 1 g Agar mikrowaving. In Schritt 1.1 3 mal zum Kochen bringen und 10 g gefrorenes Traubensaftkonzentrat hinzufügen, um die Sichtbarkeit der Eier auf dem Agarteller zu erhöhen.
- Wenn der Agar auf 55 °C abgekühlt ist, 20 ml in 100 mm Petrischalen gießen und erstarren lassen.
- Bedecken Sie die Oberfläche der Agarplatten mit einer Hefepaste, indem Sie 1 g Bierhefe mit 15 g Wasser mischen. Gießen Sie Hefepaste auf die Agarplatte, um sicherzustellen, dass die Oberfläche bedeckt ist, dann gießen Sie den Überschuss ab und hinterlassen Sie einen dünnen Heferückstand. Wenn mehrere Platten verwendet werden, kann die Paste sequenziell auf mehrere Platten gegossen werden.
- Agarplatten in den Boden eines Käfigs geben.
HINWEIS: Ein 32 oz Feinkostbehälter ist ein guter Ersatz für Acryl-Fliegenkäfige.- Machen Sie Deckel für 32 un-Fein-Behälter, indem Sie ein Loch in der Oberseite schneiden und ein atmungsaktives Netz mit ungiftigem Kleber über das Loch kleben. Wenn der Kleber wasserlöslich ist, verhindern Wassereinwirkung auf den Deckel.
- Transfer 200-300 Fliegen in den Behälter und Abdeckung mit Deckel. Bedecken Sie das netzgeschützte Loch mit einem leeren Petrischalendeckel, um verdunsten von der Agaroberfläche zu verhindern, und fügen Sie auf Wunsch ein feuchtes Gewebepapier in den Deckel ein. Inkubationsfliegen bei 25 °C über Nacht für 16-20 Std.
2. Eier sammeln
- Bereiten Sie ein Sieb für die Eiersammlung vor, indem Sie Nylongewebe in eine Kunststoffbuchse legen.
- Um den Teller mit Eiern darauf zu holen, entfernen Sie Fliegen aus dem Käfig, indem Sie in einen leeren Behälter übertragen. Wenn am nächsten Tag die gleichen Fliegen verwendet werden, müssen Sie sofort in einen neuen Käfig mit einem frisch gehebeten Traubensaft-Agar-Teller überführen. Fliegen können für 3-5 sequentielle Tage verwendet werden
- Entfernen Sie tote Fliegen aus dem Agar mit einem sauberen Pinsel, achten Sie darauf, den Agar nicht aufzubrechen.
- Sammeln Sie Eier, indem Sie die Agarplatte mit destilliertem Wasser abspülen, Eier sanft von der Agaroberfläche bürsten und die Gülle über das Netz gießen. Wiederholen Sie 3-4 Mal, bis alle oder die meisten Eier von der Agarplatte entfernt wurden.
3. Dechorionate Eier und Transfer zu steriler Ernährung
- Bereiten Sie den Biosicherheitsschrank vor, indem Sie die Innenseite (einschließlich Der Seiten) mit 70% Ethanol besprühen. Wischen Sie den Boden mit einem Laborgewebe ab und sterilisieren Sie die Kapuze mit UV-Licht für 15 min. Sterilisieren Sie alle nichtbiologischen Vorräte (Probenbecher, Pinsel, Zangen, Abfallbehälter, 400 ml sterilisiertes Wasser und 100 ml 0,6 % Natriumhypochlorit) durch Sprühen mit Ethanol und sofort in den Biosicherheitsschrank. Sterilisieren Sie mit UV-Licht für 15 min.
- Beginnen Sie die erste von 2 Natriumhypochlorit-Washes, indem Sie die Buchse mit den Eiern in einen 120 ml-Probenbecher oder einen anderen sterilen Behälter legen. Gießen Sie langsam 90 ml 0,6% Natriumhypochloritlösung in die Buchse, bis knapp unter dem Rand.
- Eier für 2,5 min abspülen. Die Eier regelmäßig wieder aussetzen, indem Sie Zangen verwenden, um die Buchse in der Hypochloritlösung nach oben und unten zu bewegen.
- Die Buchse direkt in einen zweiten, mit 90 ml Bleichmittel vorgefüllten Probenbecher in den Biosicherheitsschrank überführen.
- Wiederholen Sie Schritt 3.3 im Biosicherheitsschrank. Am Ende der zweiten Bleichbehandlung sollten die Eier beginnen, an den Seiten der Buchse zu haften.
- Führen Sie die Schritte 3.7-3.8 im Biosicherheitsschrank aus.
- Entsorgen Sie die Bleiche und waschen Sie die Buchse mit sterilem Wasser 3 mal. Die Eier während jeder Wäsche mehrmals wieder aufhängen, indem Sie die Buchse mit Zangen bewegen. Am Ende des dritten Waschens sollten die meisten Eier an der Seite der Buchse befestigt werden.
- Mit einem in Ethanol sterilisierten Pinsel eier von der Seite der Buchse auf die sterile Diät übertragen. Eier einzeln oder in kleinen Chargen übertragen. Ziel für 30-50 Eier pro Durchstechflasche. Lassen Sie die Kappen locker, damit Sauerstoff in das Rohr gelangen kann.
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