Overview
עובר דרוזופילה מוקף בקרומים החיצוניים המגוננים. כדי לקבל גישה לעובר, chorion–החיצוני ביותר של הממברנות–מוסר לעתים קרובות. וידאו זה מתאר שיטה נפוצה של dechorionation באמצעות hypochlorite נתרן. פרוטוקול הדוגמה מדגים את ההליך תוך שימוש בטכניקות סטריליות הנחוצות לגידול בעלי חיים צירניים או גנוטוביוטיים.
Protocol
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Koyle et al., גידול זבוב הפירות Drosophila melanogaster תחת תנאים אקסניק ו Gnotobiotic, J. Vis. Exp. (2016).
1. הכן כלובים מטילי ביצים
- הפוך צלחות אגר מיץ ענבים על ידי microwaving 100 מ"ל מים, 10 גרם שמרי בירה, 10 גרם גלוקוז, ו 1 גרם של אגר. מביאים לרתיחה 3 פעמים בשלב 1.1 ומוסיפים 10 גרם של תרכיז מיץ ענבים קפוא כדי להגביר את הראות של ביצים על צלחת אגר.
- כאשר אגר התקרר ל 55 מעלות צלזיוס, יוצקים 20 מ"ל לתוך 100 מ"מ פטרי מנות ולאפשר לחזק.
- מכסים את פני השטח של צלחות אגר עם משחת שמרים על ידי ערבוב 1 גרם שמרי בירה עם 15 גרם מים. יוצקים משחת שמרים על צלחת אגר לוודא את פני השטח מכוסה, ולאחר מכן לשפוך את עודף, משאיר שאריות שמרים דקים מאחור. אם נעשה שימוש בלוחות מרובים, ניתן לשפוך את הדבק ברצף ללוחות מרובים.
- מעבירים צלחות אגר לתחתית כלוב.
שים לב: מיכל מעדנייה 32 oz הוא תחליף טוב לכלובי זבוב אקריליק.- הפוך את העפעפיים עבור מיכלי מעדנייה 32 עוז על ידי חיתוך חור בחלק העליון הדבקת רשת נושמת על החור עם דבק רעיל. אם הדבק מסיס במים למנוע חשיפה למים למכסה.
- מעבירים 200-300 זבובים לתוך המיכל ומכסים במכסה. מכסים את החור המוגן באמצעות רשת עם מכסה צלחת פטרי ריק כדי למנוע אידוי מפני השטח של אגר ומוסיפים נייר רקמה לח בתוך המכסה במידת הצורך. דגירה זבובים ב 25 מעלות צלזיוס לילה במשך 16-20 שעות.
2. לאסוף ביצים
- מכינים מסננת לאיסוף ביצים על ידי הנחת רשת ניילון לתוך תותב פלסטיק.
- כדי לאחזר את הצלחת עם ביצים על זה, להסיר זבובים מהכלוב על ידי העברה למיכל ריק. אם אותם זבובים ישמשו למחרת, העבירו מיד לכלוב חדש המכיל צלחת אגר מיץ ענבים טרייה. ניתן להשתמש בזבובים במשך 3-5 ימים רצופים
- הסר זבובים מתים מן האגר עם מברשת צבע נקייה, נזהר לא לשבור את האגר.
- לאסוף ביצים על ידי שטיפת צלחת אגר עם מים מזוקקים, בעדינות צחצוח ביצים מפני השטח אגר, ושופך את תרחיף על הרשת. חוזרים על הפעולה 3-4 פעמים עד שכל הביצים או רובן הוסרו מצלחת הגר.
3. ביצים Dechorionate והעברה דיאטה סטרילית
- מכינים את ארון ההסמכה הביולוגית על ידי ריסוס החלק הפנימי (כולל צדדים) עם 70% אתנול. לנגב את התחתית עם רקמת מעבדה, לעקר את מכסה המנוע עם אור UV במשך ~ 15 דקות. לעקר את כל האספקה הלא ביולוגית (כוסות דגימה, מברשת צבע, מלקחיים, מיכל פסולת, 400 מ"ל מים מעוקרים, ו 100 מ"ל של 0.6% hypochlorite נתרן) על ידי ריסוס עם אתנול ומיד הצבת בארון biosafety. לעקר עם אור UV במשך 15 דקות.
- התחל את הראשון של 2 נתרן hypochlorite שוטף על ידי הצבת תותבים עם הביצים לתוך דגימה 120 מל או מיכל סטרילי אחר. יוצקים לאט ~ 90 מ"ל של 0.6% פתרון hypochlorite נתרן לתוך תותב עד ממש מתחת לשפה.
- שוטפים ביצים במשך 2.5 דקות. מעת לעת להשעות מחדש את הביצים באמצעות מלקחיים כדי להזיז את תותב למעלה ולמטה בתמיסה hypochlorite.
- מעבירים את התותב ישירות לתוך דגימה שנייה, מלא מראש עם אקונומיקה 90 מל, בתוך ארון biosafety.
- חזור על שלב 3.3 בתוך ארון ההסתעף הביולוגי. בסוף הטיפול השני אקונומיקה, הביצים צריך להתחיל לדבוק בצדדים של תותב.
- בצעו את שלבים 3.7-3.8 בארון הביו-רוויה.
- להשליך את האקונומיקה ולשטוף את התותב עם מים סטריליים 3 פעמים. להשעות מחדש את הביצים מספר פעמים במהלך כל כביסה על ידי הזזת תותב עם מלקחיים. עד סוף השלישי לשטוף את רוב הביצים צריך להיות מחובר לצד של תותב.
- באמצעות מכחול מעוקר באתנול, להעביר ביצים מצד התועבה לתנונה סטרילית. מעבירים ביצים בנפרד או בקבוצות קטנות. לכוון 30-50 ביצים לכל בקבוקון. השאירו את הכובעים רופפים כדי לאפשר לחמצן להיכנס לצינור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
