Overview
L'embrione Drosophila è circondato da membrane esterne protettive. Per ottenere l'accesso all'embrione, il corione- il più esterno delle membrane - viene spesso rimosso. Questo video descrive un metodo comunemente usato di dechorionation usando ipoclorito di sodio. Il protocollo di esempio dimostra la procedura utilizzando tecniche sterili necessarie per l'allevamento animale axenico o gnotobiotico.
Protocol
Questo protocollo è un estratto da Koyle et al., Allevamento della Mosca della Frutta Drosophila melanogaster Sotto condizioni axeniche e gnotobiotiche, J. Vis. Exp. (2016).
1. Preparare gabbie per la deposizione delle uova
- Preparare piatti di agar succo d'uva microwaving 100 ml di acqua, 10 g di lievito di birra, 10 g di glucosio e 1 g di agar. Portare a ebollizione 3 volte nel passaggio 1.1 e aggiungere 10 g di concentrato di succo d'uva congelato per aumentare la visibilità delle uova sul piatto di agar.
- Quando l'agar si è raffreddato a 55 °C, versare 20 ml in piastre di Petri da 100 mm e lasciare solidificare.
- Coprire la superficie dei piatti di agar con una pasta di lievito mescolando 1 g di lievito di birra con 15 g di acqua. Versare la pasta di lievito sulla piastra di agar assicurandosi che la superficie sia coperta, quindi versare l'eccesso, lasciando un sottile residuo di lievito alle spalle. Se vengono utilizzate più piastre, la pasta può essere versata in sequenza su più piastre.
- Trasferire le piastre di agar nel fondo di una gabbia.
NOTA: Un contenitore di gastronomia da 32 once è un buon sostituto delle gabbie di mosca acriliche.- Preparare coperchi per contenitori di gastronomia da 32 once tagliando un foro nella parte superiore e incollando una rete traspirante sul foro con colla non tossica. Se la colla è solubile in acqua, prevenire l'esposizione all'acqua al coperchio.
- Trasferire 200-300 mosche nel contenitore e coprire con coperchio. Coprire il foro protetto da rete con un coperchio vuoto della piastra di Petri per evitare l'evaporazione dalla superficie dell'agar e aggiungere una carta velina umida all'interno del coperchio, se lo si desidera. Incubare le mosche a 25 °C durante la notte per 16-20 ore.
2. Raccogliere le uova
- Prepara un setaccio per la raccolta delle uova posizionando la rete di nylon in una boccola di plastica.
- Per recuperare il piatto con le uova su di esso, rimuovere le mosche dalla gabbia trasferendo in un contenitore vuoto. Se le stesse mosche verranno utilizzate il giorno successivo, trasferire immediatamente in una nuova gabbia contenente un piatto di agar succo d'uva appena lievitato. Le mosche possono essere utilizzate per 3-5 giorni sequenziali
- Rimuovi le mosche morte dall'agar con un pennello pulito, facendo attenzione a non rompere l'agar.
- Raccogliere le uova risciacquando il piatto di agar con acqua distillata, spazzolando delicatamente le uova dalla superficie dell'agar e versando il liquame sulla rete. Ripetere 3-4 volte fino a quando tutte o la maggior parte delle uova non sono state rimosse dal piatto di agar.
3. Dechorionate Uova e Trasferimento a Dieta Sterile
- Preparare l'armadio per la biosicurezza spruzzando l'interno (compresi i lati) con il 70% di etanolo. Pulire il fondo con un tessuto da laboratorio e sterilizzare il cappuccio con luce UV per ~ 15 minuti. Sterilizzare tutte le forniture non biologiche (tazze campione, pennello, forcep, contenitore di rifiuti, acqua sterilizzata da 400 ml e 100 ml di ipoclorito di sodio allo 0,6%) spruzzando con etanolo e mettendo immediatamente nell'armadio della biosicurezza. Sterilizzare con luce UV per 15 minuti.
- Inizia il primo di 2 lavaggi di ipoclorito di sodio posizionando la boccola con le uova in una tazza di campioni da 120 ml o in un altro contenitore sterile. Versare lentamente ~ 90 ml di soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,6% nella boccola fino a poco sotto il bordo.
- Risciacquare le uova per 2,5 minuti. Sospendere periodicamente le uova utilizzando le forcette per spostare la boccola su e giù nella soluzione di ipoclorito.
- Trasferire la boccola direttamente in una tazza di secondo campione, preriempì con candeggina da 90 ml, all'interno dell'armadio per la biosicurezza.
- Ripetere il passaggio 3.3 all'interno dell'armadio per la biosicurezza. Alla fine del secondo trattamento di candeggina, le uova dovrebbero iniziare ad aderire ai lati della boccola.
- Eseguire i passaggi 3.7-3.8 nell'armadio per la biosicurezza.
- Scartare la candeggina e lavare la boccola con acqua sterile 3 volte. Sospendere le uova più volte durante ogni lavaggio spostando la boccola con le forcep. Entro la fine del terzo lavaggio la maggior parte delle uova dovrebbe essere attaccata al lato della boccola.
- Utilizzando un pennello sterilizzato in etanolo, trasferire le uova dal lato della boccola alla dieta sterile. Trasferire le uova singolarmente o in piccoli lotti. Puntare a 30-50 uova per flaconcino. Lasciare i tappi allentati per consentire all'ossigeno di entrare nel tubo.
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