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Encyclopedia of Experiments

Drosofilia Raccolta e dechorionation delle uova: un metodo per rimuovere lo strato di uova più esterno

Overview

L'embrione Drosophila è circondato da membrane esterne protettive. Per ottenere l'accesso all'embrione, il corione- il più esterno delle membrane - viene spesso rimosso. Questo video descrive un metodo comunemente usato di dechorionation usando ipoclorito di sodio. Il protocollo di esempio dimostra la procedura utilizzando tecniche sterili necessarie per l'allevamento animale axenico o gnotobiotico.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Koyle et al., Allevamento della Mosca della Frutta Drosophila melanogaster Sotto condizioni axeniche e gnotobiotiche, J. Vis. Exp. (2016).

1. Preparare gabbie per la deposizione delle uova

  1. Preparare piatti di agar succo d'uva microwaving 100 ml di acqua, 10 g di lievito di birra, 10 g di glucosio e 1 g di agar. Portare a ebollizione 3 volte nel passaggio 1.1 e aggiungere 10 g di concentrato di succo d'uva congelato per aumentare la visibilità delle uova sul piatto di agar.
  2. Quando l'agar si è raffreddato a 55 °C, versare 20 ml in piastre di Petri da 100 mm e lasciare solidificare.
  3. Coprire la superficie dei piatti di agar con una pasta di lievito mescolando 1 g di lievito di birra con 15 g di acqua. Versare la pasta di lievito sulla piastra di agar assicurandosi che la superficie sia coperta, quindi versare l'eccesso, lasciando un sottile residuo di lievito alle spalle. Se vengono utilizzate più piastre, la pasta può essere versata in sequenza su più piastre.
  4. Trasferire le piastre di agar nel fondo di una gabbia.
    NOTA: Un contenitore di gastronomia da 32 once è un buon sostituto delle gabbie di mosca acriliche.
    1. Preparare coperchi per contenitori di gastronomia da 32 once tagliando un foro nella parte superiore e incollando una rete traspirante sul foro con colla non tossica. Se la colla è solubile in acqua, prevenire l'esposizione all'acqua al coperchio.
  5. Trasferire 200-300 mosche nel contenitore e coprire con coperchio. Coprire il foro protetto da rete con un coperchio vuoto della piastra di Petri per evitare l'evaporazione dalla superficie dell'agar e aggiungere una carta velina umida all'interno del coperchio, se lo si desidera. Incubare le mosche a 25 °C durante la notte per 16-20 ore.

2. Raccogliere le uova

  1. Prepara un setaccio per la raccolta delle uova posizionando la rete di nylon in una boccola di plastica.
  2. Per recuperare il piatto con le uova su di esso, rimuovere le mosche dalla gabbia trasferendo in un contenitore vuoto. Se le stesse mosche verranno utilizzate il giorno successivo, trasferire immediatamente in una nuova gabbia contenente un piatto di agar succo d'uva appena lievitato. Le mosche possono essere utilizzate per 3-5 giorni sequenziali
  3. Rimuovi le mosche morte dall'agar con un pennello pulito, facendo attenzione a non rompere l'agar.
  4. Raccogliere le uova risciacquando il piatto di agar con acqua distillata, spazzolando delicatamente le uova dalla superficie dell'agar e versando il liquame sulla rete. Ripetere 3-4 volte fino a quando tutte o la maggior parte delle uova non sono state rimosse dal piatto di agar.

3. Dechorionate Uova e Trasferimento a Dieta Sterile

  1. Preparare l'armadio per la biosicurezza spruzzando l'interno (compresi i lati) con il 70% di etanolo. Pulire il fondo con un tessuto da laboratorio e sterilizzare il cappuccio con luce UV per ~ 15 minuti. Sterilizzare tutte le forniture non biologiche (tazze campione, pennello, forcep, contenitore di rifiuti, acqua sterilizzata da 400 ml e 100 ml di ipoclorito di sodio allo 0,6%) spruzzando con etanolo e mettendo immediatamente nell'armadio della biosicurezza. Sterilizzare con luce UV per 15 minuti.
  2. Inizia il primo di 2 lavaggi di ipoclorito di sodio posizionando la boccola con le uova in una tazza di campioni da 120 ml o in un altro contenitore sterile. Versare lentamente ~ 90 ml di soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,6% nella boccola fino a poco sotto il bordo.
  3. Risciacquare le uova per 2,5 minuti. Sospendere periodicamente le uova utilizzando le forcette per spostare la boccola su e giù nella soluzione di ipoclorito.
  4. Trasferire la boccola direttamente in una tazza di secondo campione, preriempì con candeggina da 90 ml, all'interno dell'armadio per la biosicurezza.
  5. Ripetere il passaggio 3.3 all'interno dell'armadio per la biosicurezza. Alla fine del secondo trattamento di candeggina, le uova dovrebbero iniziare ad aderire ai lati della boccola.
  6. Eseguire i passaggi 3.7-3.8 nell'armadio per la biosicurezza.
  7. Scartare la candeggina e lavare la boccola con acqua sterile 3 volte. Sospendere le uova più volte durante ogni lavaggio spostando la boccola con le forcep. Entro la fine del terzo lavaggio la maggior parte delle uova dovrebbe essere attaccata al lato della boccola.
  8. Utilizzando un pennello sterilizzato in etanolo, trasferire le uova dal lato della boccola alla dieta sterile. Trasferire le uova singolarmente o in piccoli lotti. Puntare a 30-50 uova per flaconcino. Lasciare i tappi allentati per consentire all'ossigeno di entrare nel tubo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002 http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897 http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch) NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

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Fonte: Koyle, M. L., et al. J. Vis. Exp. (2016).

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