Overview
드로소필라 배아는 보호적인 외부 막으로 둘러싸여 있습니다. 배아에 접근하기 위하여는, chorion- 막의 가장 바깥쪽 - 수시로 제거됩니다. 이 비디오는 나트륨 hypochlorite를 사용하여 일반적으로 사용되는 비초화 방법을 설명합니다. 이 예제 프로토콜은 축또는 노토바이오틱 동물 사육에 필요한 멸균 기술을 사용하는 동안 절차를 보여줍니다.
Protocol
이 프로토콜은 코일 외에서발췌, 악센과 노토바이오틱 조건에서 과일 플라이 드로소필라 멜라노가스터를 사육, J. Vis. Exp. (2016).
1. 계란 누워 케이지를 준비
- 포도 주스 한천 접시를 100ml 의 물, 맥주 효모 10g, 포도당 10g, 한천 1 g로 만듭니다. 1.1단계에서 3번 끓이고 냉동 포도 주스 농축액 10g을 첨가하여 한천 판에 달걀의 가시성을 높입니다.
- 한천이 55°C로 식으면 20ml를 100mm 페트리 접시에 붓고 고형화할 수 있습니다.
- 1g 브루어 효모의 효모를 15g의 물과 혼합하여 한천 판의 표면을 효모 페이스트로 덮습니다. 표면이 덮여 있는지 확인하기 위해 천 접시에 효모 페이스트를 붓고, 과잉을 부어 얇은 효모 잔류물을 뒤에 둡시. 여러 플레이트를 사용하는 경우 붙여넣기를 여러 플레이트에 순차적으로 부을 수 있습니다.
- 천판을 케이지 바닥으로 옮길 수 있습니다.
참고: 32 온스 델리 용기는 아크릴 플라이 케이지를 대체할 수 있습니다.- 상단의 구멍을 자르고 독성이 없는 접착제로 구멍 에 통기성 있는 메쉬를 붙임으로써 32 온스 델리 용기의 뚜껑을 만듭니다. 접착제가 용해되면 뚜껑에 물에 노출되는 것을 방지합니다.
- 200-300파리를 용기에 옮기고 뚜껑으로 덮습니다. 메쉬 보호 구멍을 빈 페트리 접시 뚜껑으로 덮고 식기 표면에서 증발하는 것을 방지하고 원하는 경우 뚜껑 내부에 촉촉한 티슈 페이퍼를 추가하십시오. 인큐베이션은 16-20 시간 동안 하룻밤 사이에 25 °C에서 날아갑니다.
2. 계란 을 수집
- 나일론 메쉬를 플라스틱 부싱에 배치하여 달걀 수집체를 준비합니다.
- 접시에 달걀이 있는 접시를 회수하려면 빈 용기로 옮겨 케이지에서 파리를 제거합니다. 다음 날 동일한 파리를 사용하는 경우 갓 효모한 포도 주스 한천 접시가 들어있는 새 케이지로 즉시 옮으시면 됩니다. 파리는 3-5 순차일에 사용할 수 있습니다.
- 깨끗한 페인트 브러시로 한고에서 죽은 파리를 제거하고, 한천을 분해하지 않도록주의하십시오.
- 한천 판을 증류수로 헹구고, 한천 표면에서 달걀을 부드럽게 닦고, 슬러리를 메쉬 위에 붓어 계란을 수집합니다. 계란의 전부 또는 대부분이 한천 접시에서 제거 될 때까지 3-4 번 반복하십시오.
3. 계란을 데초리오네이트하고 멸균 식단으로 이전
- 70%의 에탄올로 내부(측면 포함)를 분사하여 생물안전 캐비닛을 준비합니다. 실험실 조직으로 바닥을 닦고 UV 빛으로 후드를 15 분 동안 살균하십시오. 모든 비생물학적 소모품(표본컵, 페인트브러시, 집게, 폐수, 멸균수 400ml, 고가염소산나트륨 100ml)을 에탄올로 분사하고 즉시 바이오 안전 캐비닛에 배치하여 살균합니다. 15 분 동안 UV 빛으로 살균하십시오.
- 120ml 표본 컵 또는 다른 멸균 용기에 계란으로 부시를 배치하여 2 개의 나트륨 hypochlorite 세차제 중 첫 번째를 시작합니다. 0.6% 나트륨 하이포염소용 액액을 0.6% 의 90ml를 서서히 부싱에 붓고 가장자리 바로 아래까지 붓습니다.
- 계란을 2.5분 동안 헹구습니다. 주기적으로 집게를 사용하여 알을 다시 일시 중단하여 하이포염소염 용액에서 부시를 위아래로 움직입니다.
- 부시를 생물 안전 캐비닛 내부에 90ml 표백제로 미리 채워진 두 번째 표본 컵으로 직접 옮기습니다.
- 바이오 세이프티 캐비닛 내부의 3.3 단계를 반복합니다. 두 번째 표백제 치료가 끝나면 계란은 부싱의 측면을 고수하기 시작해야합니다.
- 생물 안전 캐비닛에서 3.7-3.8 단계를 수행하십시오.
- 표백제를 버리고 멸균물로 부싱을 3번 씻습니다. 집게로 부싱을 이동하여 각 세척 중에 계란을 여러 번 다시 중단합니다. 세 번째 세척이 끝날 때까지 대부분의 계란은 부싱 의 측면에 부착해야합니다.
- 에탄올에 멸균된 페인트브러시를 사용하여 부싱 측에서 멸균 식단으로 계란을 옮길 수 있습니다. 계란을 개별적으로 또는 소량으로 옮기. 바이알 당 30-50 개의 계란을 목표로하십시오. 산소가 튜브에 들어갈 수 있도록 캡을 느슨하게 둡니다.
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