Overview
O embrião Drosophila é cercado por membranas externas protetoras. Para ter acesso ao embrião, o acorde – o mais externo das membranas – é frequentemente removido. Este vídeo descreve um método comumente usado de descorionação usando hipoclorito de sódio. O protocolo de exemplo demonstra o procedimento ao empregar técnicas estéreis necessárias para a criação de animais gnósticos ou gnósticos.
Protocol
Este protocolo é um trecho de Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobitic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).
1. Prepare gaiolas de colocação de ovos
- Faça pratos de ágar de suco de uva microwaving 100 ml de água, levedura de 10 g cervejeiro, 10 g de glicose e 1 g de ágar. Deixe ferver 3 vezes na etapa 1.1 e adicione 10 g de concentrado de suco de uva congelado para aumentar a visibilidade dos ovos na placa de ágar.
- Quando o ágar esfriar a 55 °C, despeje 20 ml em pratos petri de 100 mm e deixe solidificar.
- Cubra a superfície das placas de ágar com uma pasta de levedura misturando levedura de 1 g com 15 g de água. Despeje pasta de levedura na placa de ágar certificando-se de que a superfície está coberta e, em seguida, despeje o excesso, deixando um resíduo fino de levedura para trás. Se várias placas forem usadas, a pasta pode ser derramada sequencialmente em várias placas.
- Transfira placas de ágar para o fundo de uma gaiola.
NOTA: Um recipiente de 32 oz deli é um bom substituto para gaiolas de moscas acrílicas.- Faça tampas para recipientes de 32 oz deli cortando um orifício na parte superior e colando uma malha respirável sobre o orifício com cola não tóxica. Se a cola for solúvel em água, evite a exposição à água à tampa.
- Transfira 200-300 moscas para dentro do recipiente e cubra com tampa. Cubra o orifício protegido por malha com uma tampa de placa de Petri vazia para evitar a evaporação da superfície do ágar e adicione um papel de tecido úmido dentro da tampa, se desejar. Incubar voa a 25 °C durante a noite durante 16-20 horas.
2. Coletar ovos
- Prepare uma peneira para a coleta de ovos colocando malha de nylon em uma bucha de plástico.
- Para recuperar a placa com ovos, remova as moscas da gaiola transferindo-se para um recipiente vazio. Se as mesmas moscas serão usadas no dia seguinte, transfira imediatamente para uma nova gaiola contendo um prato de ágar de suco de uva recém-levenso. Moscas podem ser usadas por 3-5 dias sequenciais
- Remova moscas mortas do ágar com um pincel limpo, tomando cuidado para não quebrar o ágar.
- Colete ovos enxaguando a placa de ágar com água destilada, escovando suavemente ovos da superfície do ágar e derramando o chorume sobre a malha. Repita 3-4 vezes até que todos ou a maioria dos ovos tenham sido removidos da placa de ágar.
3. Ovos descolados e transferência para dieta estéril
- Prepare o armário de biossegurança pulverizando o interior (incluindo os lados) com 70% de etanol. Limpe o fundo com um tecido de laboratório e esterilize o capô com luz UV por ~15 min. Esterilize todos os suprimentos não biológicos (copos de espécime, pincel, fórceps, recipiente de resíduos, 400 ml de água esterilizada e 100 ml de hipoclorito de sódio de 0,6%) pulverizando com etanol e imediatamente colocando no armário de biossegurança. Esterilize com luz UV por 15 minutos.
- Inicie a primeira de 2 lavagens de hipoclorito de sódio colocando a bucha com os ovos em um copo de espécime de 120 ml ou outro recipiente estéril. Despeje lentamente ~90 ml de solução de hipoclorito de sódio de 0,6% na bucha até logo abaixo da borda.
- Enxágüe ovos por 2,5 min. Suspender periodicamente os ovos usando fórceps para mover a bucha para cima e para baixo na solução de hipoclorito.
- Transfira a bucha diretamente para um segundo copo de espécime, pré-preenchido com alvejante de 90 ml, dentro do armário de biossegurança.
- Repita o passo 3.3 dentro do armário de biossegurança. No final do segundo tratamento alvejante, os ovos devem começar a aderir aos lados da bucha.
- Realizar etapas 3.7-3.8 no gabinete de biossegurança.
- Descarte o alvejante e lave a bucha com água estéril 3 vezes. Suspenda os ovos várias vezes durante cada lavagem movendo a bucha com fórceps. Até o final da terceira lavagem, a maioria dos ovos deve ser anexada ao lado da bucha.
- Usando um pincel esterilizado em etanol, transfira ovos do lado da bucha para a dieta estéril. Transfira ovos individualmente ou em pequenos lotes. Aponte para 30-50 ovos por frasco. Deixe as tampas soltas para permitir que o oxigênio entre no tubo.
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