Overview
Drosophila embryot är omgivet av skyddande yttre membran. För att få tillgång till embryot avlägsnas ofta käk- membranens yttersta. Denna video beskriver en vanligt förekommande metod för dechorionation med natriumhypoklorit. Exempelprotokollet visar förfarandet samtidigt som sterila tekniker som är nödvändiga för yxnisk eller gnotobiotisk djuruppfödning används.
Protocol
Detta protokoll är ett utdrag från Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).
1. Förbered äggläggande burar
- Gör druvjuice agar tallrikar genom att mikrowaving 100 ml vatten, 10 g bryggerjäst, 10 g glukos och 1 g agar. Koka upp 3 gånger i steg 1.1 och tillsätt 10 g fryst druvsaftkoncentrat för att öka synligheten av ägg på agarplattan.
- När agar har svalnat till 55 °C, häll 20 ml i 100 mm petriskålar och låt stelna.
- Täck ytan på agarplattorna med en jästpasta genom att blanda 1 g bryggerjäst med 15 g vatten. Häll jästpasta på agarplattan och se till att ytan är täckt och häll sedan av överskottet och lämna en tunn jästrester bakom. Om flera plattor används kan pastan sekventiellt hällas på flera plattor.
- Överför agarplattor till botten av en bur.
OBS: En 32 oz deli behållare är en bra ersättning för akryl flugburar.- Gör lock för 32 oz deli behållare genom att skära ett hål i toppen och limma ett ventilerande nät över hålet med giftfritt lim. Om limet är vattenlösligt, förhindra vattenexponering för locket.
- Överför 200-300 flugor i behållaren och täck med lock. Täck det nätskyddade hålet med ett tomt petriskållock för att förhindra avdunstning från agarytan och tillsätt ett fuktigt vävnadspapper inuti locket om så önskas. Inkubera flugor vid 25 °C över natten i 16-20 timmar.
2. Samla ägg
- Förbered en sikt för äggsamling genom att placera nylonnät i en plastbussning.
- För att hämta plattan med ägg på den, ta bort flugor från buret genom att överföra till en tom behållare. Om samma flugor kommer att användas nästa dag, överför omedelbart till en ny bur som innehåller en nyjäst druvjuice agarplatta. Flugor kan användas i 3-5 sekventiella dagar
- Ta bort döda flugor från agaren med en ren pensel, var noga med att inte bryta upp agaren.
- Samla ägg genom att skölja agarplattan med destillerat vatten, borsta försiktigt ägg från agarytan och hälla slammet över nätet. Upprepa 3-4 gånger tills alla eller de flesta ägg har tagits bort från agarplattan.
3. Dechorionate ägg och överföring till steril kost
- Förbered biosäkerhetsskåpet genom att spruta insidan (inklusive sidorna) med 70% etanol. Torka av botten med en labbvävnad och sterilisera huven med UV-ljus i ~15 min. Sterilisera alla icke-biologiska förnödenheter (provkoppar, pensel, tång, avfallsbehållare, 400 ml steriliserat vatten och 100 ml 0,6% natriumhypoklorit) genom att spruta med etanol och omedelbart placera i biosäkerhetsskåpet. Sterilisera med UV-ljus i 15 min.
- Börja den första av 2 natriumhypoklorittvättar genom att placera bussningen med äggen i en 120 ml provkopp eller annan steril behållare. Häll långsamt ~ 90 ml 0,6% natriumhypokloritlösning i bussningen till strax under kanten.
- Skölj ägg i 2,5 min. Suspendera regelbundet äggen igen genom att använda tång för att flytta bussningen upp och ner i hypokloritlösningen.
- Överför bussningen direkt till en andra provkopp, förfylld med 90 ml blekmedel, inuti biosäkerhetsskåpet.
- Upprepa steg 3.3 inuti biosäkerhetsskåpet. I slutet av den andra blekbehandlingen bör äggen börja klibba sig på sidorna av bussningen.
- Utför steg 3.7-3.8 i biosäkerhetsskåpet.
- Kassera blekmedlet och tvätta bussningen med sterilt vatten 3 gånger. Häng äggen flera gånger under varje tvättning genom att flytta bussningen med tång. I slutet av den tredje tvätten bör de flesta ägg fästas på sidan av bussningen.
- Använd en pensel steriliserad i etanol, överför ägg från sidan av bussningen till den sterila kosten. Överför ägg individuellt eller i små partier. Sikta på 30-50 ägg per flaska. Låt locken vara lösa så att syre kan komma in i röret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
