Summary
عزل الخلايا الجذعية من الأنسجة العضلية الناعمة على أساس سرعة الانضمام إلى الخلية القارورة.
Abstract
منذ فترة طويلة الخلايا الجذعية البالغة التي نوقشت في ما يخص تطبيقها في مجال الطب التجديدي. لقد ولدت الخلايا الجذعية للبالغين قدرا كبيرا من الإثارة لعلاج الجرحى والأنسجة المريضة بسبب قدراتها على الخضوع للإعجاب متعددة النسب تمايز الخلايا وقدرتها على التجدد الذاتي. الأهم من ذلك ، جعلت هذه الصفات من المفيد لهم لاستخدامها في علاجات ذاتي زرع الخلايا. والبروتوكول الحالي يعرض القراء إلى تقنية تعديل preplate حيث الأنسجة الرخوة في الجهاز الحركي ، مثل الأوتار والعضلات ، هي 1
Protocol
بشكل عام ، واستكمال إجراءات تعديل preplate يتطلب 1-2 أيام من التحضير ، 1 اسبوع من تنفيذ الإجراء التقني ، 2-3 أيام لتحديد هوية الخلية مع كيمياء سيتولوجية مناعية ، ومبلغا إضافيا 2-3 أسابيع من الخلايا الجذعية والتوسع السكاني. المعدات اللازمة لزراعة الخلايا الجذعية هي مماثلة لتلك التي من غيرها من النظم التي تشمل الثقافة الخلية مقعد العلوي الطرد المركزي ، حاضنة CO 2 ، رقائقي زراعة الأنسجة وغطاء تدفق مجهر مقلوب مجهزة مضان وكاميرا رقمية. الخلايا الجذعية المعزولة يمكن أيضا أن تكون مستنسخة ، ويمكن تخزينها على المدى الطويل في النيتروجين السائل ل1،2 الدراسات الحالية أو المستقبلية. يجب على جميع الكواشف والمواد المستخدمة لهذا الإجراء أن يكون عقيما والتعامل معها جو معقم و مطهر.
الخطوة 1 : إعداد
- الكولاجين الأطباق الثقافة معطف النسيج والقوارير : النوع الأول الكولاجين المستمدة من جلد العجل (0.1 غرام في 1 لتر ؛ سيغما الدريخ). وبلستيكور إلى معطف يشمل : T - 25 قوارير ، 6 أو 12 لوحات جيدة ، والأطباق (60 و 100 ملم ، BD فالكون) كما هو موضح قبل 1،2. يهز بلطف بلستيكور كل نصف ساعة ، لمدة 4 ساعات لضمان طلاء حتى من الكولاجين. ثم تتم إزالة الحل الكولاجين. وسمح بعد ذلك ليجف بلستيكور مغلفة في نسيج الثقافة هود مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية وغطاء محرك السيارة كل يوم ، لضمان العقم ، وأوجز في النهاية أو تغطيتها لاستخدامها لاحقا.
- تعد الخلية مستنبت : 400mL DMEM (DMEM والجلوكوز المرتفعة ؛ Invitrogen) ، 50mL الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS ، Invitrogen) ، 50mL مصل الحصان (HS ، Invitrogen) ، و 5 مل استخراج الجنين الفرخ (أوروبا الوسطى والشرقية ؛ الدقيقة كيميكال ) سيتم تصفيتها باستخدام الفراغ المتاح 0.22 ميكرومتر ، 500 مل نظام تصفية العقيمة (كورنينج). وستضاف العقيمة البنسلين / حل الستربتوميسين (Invitrogen) وأخيرا 100 وحدة / مل. ويمكن تخزين الحلول التي يجري اعدادها في 4 درجات مئوية واحدة على الأقل شهريا. ويستخدم هذا الحل لفصل الخلايا من القارورة عند تقسيم الثقافات أو إعداد الخلايا للزرع.
- الاحماء حلول لعزل الخلية : والكواشف التالية تحتاج إلى أن تكون درجة حرارة تصل إلى 37 درجة قبل استخدامها لعزل الخلايا C : الحل هانك في سولت التخزين المؤقت (HBSS ، Invitrogen) 0.2 ٪ (وزن / المجلد) كولاجيناز من نوع الحادي عشر (سيغما الدريخ) ، بمتوسط قدره 3200 وحدة الهضم الكولاجين في HBSS مل ؛ Dispase 2.4 units/1mL (Invitrogen) 0.5 ٪ (وزن / المجلد) التربسين (Invitrogen).
- تعقيم المعدات الجراحية في التحضير : تتطلب عملية جراحية معقمة الأدوات الجراحية بما في ذلك : مختلفة الحجم الملقط ، المقص الصغير ، مقص القزحية و / أو شفرات المشرط. بالإضافة إلى ذلك ، 15 و 50 مل من أنابيب البولي بروبلين الطرد المركزي دينار بحريني (فالكون) ؛ مصفاة الخلية (حجم المسام 70 م) دينار بحريني (فالكون) ؛ 18 -- ، 23 -- و 27 - قياس الإبر دينار بحريني (PrecisionGlide) ؛ و 10 -- أو 20 مل المحاقن المعقمة (دينار بحريني).
الخطوة 2 : الخزعات النسيجية والعزلة والتفكك الميكانيكية 1-4
يتم تنفيذ خزعات الأنسجة تحت غطاء الثقافة معقمة ويتم الحصول عليها حديثا تشمل الأوتار والعضلات الهيكلية التي تحصد من عضلات الساق أو النعلية من hindlimb البرية من نوع الفئران (C57BL/6J أنثى ، 4-5 أسابيع من العمر أو أقل جاكسون ، المختبر). ثم تتم إزالة أي نوع من الأنسجة الضامة وضوحا ، والأوعية الدموية والأنسجة الدهنية من عينات الخزعة. ثم يتم أنسجة الأوتار والعضلات التي تم تحديدها بعناية تحت مجهر تشريح الجراحي للتخلص من بقايا الجلد والعظام وتوضع في طبق يحتوي على البارد (4 درجات مئوية) HBSS (تستكمل مع إضافة 5 ٪ من FBS). ثم يتم وضعها في الأنسجة المعزولة بشكل منفصل على الأطباق التي تحتوي على الكولاجين المغلفة HBSS الباردة وسيتم المفروم (<1x1 مم 3) في الطين الخشنة باستخدام المقص الصغير و / أو شفرات المشرط.
الخطوة 3 : الهضم الأنزيمية للأنسجة :
النسيج المفروم ثم يتم فصلها إنزيمي من خلال سلسلة من الخطوات 2،4،5
- نقل عجائن الأنسجة في أنابيب مفروم 15 مل منفصلة وأجهزة الطرد المركزي في 3500 دورة في الدقيقة ~ في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف ، ويغسل مع HBSS الطرد المركزي وكرر مرة أخرى.
- إزالة طاف ، وهضم هذه عجائن بإضافة 10 مل من prewarmed كولاجيناز الحادي عشر من نوع 0.2 ٪ (سيغما). احتضان لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية في حين تعصف باستمرار بلطف الأنابيب. بدلا من ذلك ، يهز باليد كل 10 دقيقة.
- الطرد المركزي وهذه resuspend عجائن في dispase 10 مل (2.4 وحدة / مل ، Gibco) حل. احتضان لمدة 45 دقيقة عند درجة 37 ، مع اهتزاز اليدين أو الهزاز برفق كل 10 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي ، وإعادة تعليق هذه عجائن في 10 مل من محلول 0.2 ٪ HBSS التربسين. سوف الحضانة تختلف استنادا إلى أي مدى يتم الإفراج عن واحد من الخلايا والأنسجة التي يمكن القيام بها من خلال مراقبة وقف تحت المجهر. فمن لا ننصح أن تتجاوز 30 دقيقة في 37 مع أنابيب لعكس درجة مئوية أو الهزاز برفق كل 10 دقيقة.
- الطرد المركزي الخلية الناتجةق ، وإعادة تعليق. الكرية خلية في 10 مل من انتشار الأسلحة النووية المتوسطة (AM)
- فصل تعليق الخلية وذلك بتمرير استخراج من خلال سلسلة من الإبر. يتم تمرير الخلايا ثم 2 مرات خلال 18G ، ثم 23G ، وأخيرا إبرة 27G.
- تمرير استخراج الخلايا من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر.
الخطوة 4 : Preplating لعزل السكان خلية مختلفة استنادا التصاق الخلية معدل 1-3
- الطرد المركزي وresuspend الكريات خلية في متوسطة الانتشار.
- لوحة الخلية مخاليط على قارورة T - 25 الكولاجين المغلفة (أو 60 طبق مم) ، وعلامة على أنها PP1. ينبغي التقيد بوقف الخلية كما تملك أعدادا كبيرة من نوى الانكسار وغيرها من الحطام تحت المجهر.
- احتضان عند 37 درجة مئوية في ترطيب ، 5 ٪ CO 2 الحاضنة لمدة 2 ساعة.
- نقل الخلايا إلى nonadherent المغلفة الكولاجين الجديد T - 25 قارورة (أو 60 طبق مم) ، وكما هو العلامة PP2. إضافة 5 مل من PM في لوحة المسمى PP1. الخلايا المبكرة التي يعلقونها على التمسك القارورة هي في معظمها myofibroblasts 3.
- إرجاع القوارير إلى حاضنة لمدة 24 ساعة ، ونقل الخلايا إلى nonadherent المغلفة الكولاجين الجديد T - 25 قارورة (أو صحن) وعلامة على أنها PP3. إضافة 5 مل من انتشار الأسلحة النووية متوسطة في لوحة المسمى PP2. هذه الخلايا التي تعلق الانضمام إلى هذه القارورة هي في معظمها 2،3 الليفية.
- عودة إلى قوارير الحاضنة وكرر الإجراء في آخر 24 ساعة حتى يتم إنشاء PP6 السكان. الحفاظ على كل مجموعة من الخلايا مع وقف التنفيذ والسماح لهم تتكاثر وفحصها بانتظام باستخدام مجهر مقلوب. PP3 - PP4 معظمها myoblasts بينما غالبا ما ينظر إلى خلايا العضلات الأقمار الصناعية معظمها في PP5 2.
- معظم الخلايا ببطء التمسك نعلق عادة PP6. في هذه المرحلة ، وتظهر الخلايا ، صغيرة مدورة ، انكسار الضوء وتندر جدا في عدد وتعتبر أن يكون عدد السكان 1،2 الخلية الجذعية.
الخطوة 5 : تحديد وتوسيع الخلايا الجذعية المعزولة
- المعزولة PP6 الخلايا هي قليلة جدا في العدد والحاجة إلى الحفاظ عليها في متوسطة FBS انتشار الغني (20 ٪ في DMEM FBS) التي يتم تغييرها يوميا. معظم هذه الخلايا موجودة في ثقافة الموت PP6 خلال الأسابيع التالية للزراعة 1-2 ، ولكن عادة ما يتم إنشاؤه ، وصحية كبيرة PP6 السكان بعد أسابيع 1-2 إضافية للتوسع. الخلايا الجذعية المعزولة من الفئران شديدة التعبير عن الخلية الجذعية مستضد 1 (Sca1) ، CD34 ، الكبد الجنين كيناز 1 (Flk1) ، وعلامات أخرى 1،2،6،7 الجذعية التي يمكن تصور عبر تلطيخ immunocytochemical. هذه الخلايا الجذعية أيضا يحمل قدرات متعددة التمايز 3،6،8.
- تتم المحافظة على الخلايا المعزولة وتوسعت في مناطق ذات كثافة منخفضة في خلية ثقافة (12 الأطباق جيدا في الخلايا 5-10 / جيد أو <التقاء 20-30 ٪ في قارورة أو صحن) لتجنب 1،2 التمايز. عدد قليل جدا من الخلايا شكل الحيوانات المستنسخة خلال التوسع ، وهذه الخلايا الجذعية المستنسخة يمكن الخضوع لفترة طويلة الانتشار الوقت (الكمونية) لأي اختصاص دراسات أخرى. استنساخ الخلايا الجذعية يمكن أيضا تخزينها في النيتروجين السائل باستخدام الإجراءات العامة لتخزين الخلايا مثل المتوسطة PM DMSO مع 10 ٪. جعل عددا من الأرصدة في ممر منخفض من الخلايا الجذعية لأية دراسات أخرى احتياطية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم الاعتراف بأن بعض أنسجة البالغين تحتوي على خلايا جذعية متعددة. على مدى السنوات القليلة الماضية من الدراسة ، وقد تم الكشف عن الخلايا الجذعية في الأنسجة العضلية الناعمة لل، بما في ذلك الهيكل العظمي والعضلات والأوتار. هذا البروتوكول الحالي تفاصيل إجراء ، والمعروفة باسم تقنية preplate المعدلة ، التي استخدمت بنجاح في المختبر لدينا لعزل الخلايا الجذعية من الأوتار والعضلات والهيكل العظمي. ويمكن باستخدام تقنية preplate تعديل الخلايا المذكورة أعلاه يمكن تقسيمها إلى عدة السكان على أساس الخصائص التصاق لقوارير الكولاجين المغلفة (الشكل 1). وmyofibroblasts الليفية الموجودة داخل أنسجة التقيد بسرعة إلى قوارير الكولاجين مغلفة في غضون 24-48 ساعة ، ويتم فصلها في البداية من الخلايا الأخرى في PP2 - PP1. خلايا مولدة للعضل أو البطانية التمسك قوارير الكولاجين المغلفة بعد فترة زمنية أطول ، في غضون 48-96 ساعة (PP3 - PP5) ، ويمكن حصاده والتي حددها علامات على سطح الخلية. وتعتبر الخلايا preplated في وقت لاحق ، أو 96 ساعة في وقت لاحق (PP6) ، والخلايا الجذعية للبالغين (الشكل 2). خلايا صغيرة تظهر في وقت متأخر preplate ، الجولة ، وشفافة في بداية عزلتهم ، ويمكن أن تتسم بمزيد من التدفق الخلوي أو كيمياء سيتولوجية مناعية للتعبير بها عن مستضد الخلايا الجذعية 1 (Sca1) ، CD34 ، الكبد الجنين كيناز 1 (Flk1) ، و علامات أخرى من الخلايا الجذعية (الشكل 3). الخلايا الجذعية المعزولة لديها القدرة على التجديد الذاتي والدراسات التجريبية أثبتت multipotency من خلال المفاضلة الخاصة بهم في الطبقات الجرثومية الثلاث : الأديم المتوسط ، الأديم الظاهر والأديم الباطن 9. وقد كشفت التحقيقات أيضا أن العديد من هذه الخلايا الجذعية إلى خلايا تفرق من سلالة الأديم المتوسط بما في ذلك osteocytes ، الخلايا الشحمية ، غضروفية ، والخلايا المكونة للدم 6،8. وقد أظهرت دراسات أخرى أن الخلايا الجذعية البالغة في التفريق الأنساب الخلية الأديم الظاهر من خلال التعبير عنها من علامات العصبية والخلايا الدبقية وقدرتها على تحسين وظيفة أطرافهم بعد أن تم تلف الأعصاب الطرفية 10. كانت هذه الخلايا الجذعية البالغة معزول مفيدة لإصلاح الأنسجة العضلية وإصابة المريضة ، وأجريت دراسات أخرى ذات صلة في الجسم الحي على الأنسجة الأخرى بما في ذلك القلب والكبد والنخاع الشوكي ، وكذلك ظروف طبية معينة مثل مخاطية الأمعاء والمثانة صغيرة لعلاج سلس البول الإجهاد 9.
الشكل 1.
الشكل 2.
الشكل 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
المؤلفون ممتنون كثيرا من السيدة هاى يينغ بان والسيد إيان Bellayr لما قدموه من مساعدة تقنية على عزل خلية للأفلام الحالي ، والسيد كايل هولدن والسيد جوناثان لوكاس لمساعدتهم على تحرير الشريحة. جزيل الشكر إلى القائمة التالية للأشخاص الذين تورطوا مع تطور التقنيات preplate تعديل على مدى السنوات الماضية : الدكاترة. برهان غرايبة ، تساو BaoHong ، بريدجيت Deasy ، توماس باين R. ، لو اى بينغ ، Hairong بنغ ، هيديكي أوشيما ، بو تسنغ شياو دونغ مو ، Kimimasa Tobita رون يانكوفسكي ، Makato Ikezawa. نحن ممتنون للمساعدة التقنية من جيمس H. الكمون ، Pruchnic ريان ، Feduska جوزيف ، ريبيكا Schugar جيم ، وعموم هاى يينغ وTebbets جيسيكا. المؤلف كما يود أن نعترف بالدعم المالي لهذا العمل من رابطة الضمور العضلي (MDA) ، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) ، وزارة الدفاع (DOD) ، مستشفى الأطفال في بيتسبرغ من UPMC ، وإدارة جراحة العظام ، وجامعة بيتسبرغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11995-073 | |
| FBS | Invitrogen | #10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | #26050-088 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | #CE650T-10 | |
| 100U ml penicillin/streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | #14190-250 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Invitrogen | #24020-117 | |
| Collagenase type XI 0.2%(wt/vol) | Sigma-Aldrich | #C7657 | |
| Dispase2.4U ml | Invitrogen | #17105-041 | |
| Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250) | Invitrogen | #15400-054 | |
| Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter | Sigma-Aldrich | #C-9791 | |
| DMSO | Sigma | #D-2650 |
References
- Gharaibeh, B. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
- Qu-Petersen, Z. Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration. J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).
- Li, Y. &, Huard, J. Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle. Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).
- Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &, Sloper, J. C. Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse. J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).
- Lu, A. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).
- Lee, J. Y. Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing. J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).
- Cao, B. The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers. Gene Ther. 8, 627-637 (2001).
- Cao, B. Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential. Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).
- Huard, J. Regenerative medicine based on muscle stem cells. J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).
- Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &, Huard, J. Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells. J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).
