Summary
Isolating adulten Stammzellen aus Muskel-Skelett Weichteile auf der Grundlage der Zelle Einhaltung Geschwindigkeit Kolben.
Abstract
Adulte Stammzellen sind seit langem in Bezug auf ihre Anwendung in der regenerativen Medizin diskutiert. Adulte Stammzellen haben eine große Aufregung für die Behandlung von verletzten und erkrankten Geweben durch ihre beeindruckenden Fähigkeiten, um multi-lineage Zelldifferenzierung und ihre Selbst-Erneuerung unterzogen Fähigkeit generiert. Am wichtigsten ist, haben diese Eigenschaften machten sie vorteilhaft für die Verwendung bei der autologen Stammzelltransplantation Therapien. Das aktuelle Protokoll wird der Leser auf die veränderten Vorbeschichtungszyklus Technik, bei der Weichteile des Bewegungsapparates, zB Sehnen und Muskeln, sind 1 einführen
Protocol
In der Regel erfordert die vollständige geändert Vorbeschichtungszyklus Verfahren 1-2 Tage Vorbereitung, 1 Woche für die Durchführung der technischen Verfahren, 2-3 Tage der Zelle Identifikation mit Immunzytochemie, und eine zusätzliche 2-3 Wochen von Stammzellen Bevölkerung Expansion. Die Ausrüstung für die Stammzell-Kultur erforderlich sind, ähnlich wie bei anderen Zellkulturen, die eine Tischzentrifuge, CO 2-Inkubator, Laminar Flow Gewebekultur Kapuze und einem inversen Mikroskop mit Fluoreszenz-und einer digitalen Kamera ausgestattet sind. Die isolierten Stammzellen können auch geklont werden können und langfristig aufbewahrt in flüssigem Stickstoff für die aktuelle und zukünftige Studien 1,2 sein. Alle Reagenzien und Materialien für dieses Verfahren verwendet werden, müssen steril sein und behandelt aseptisch.
Schritt 1: Vorbereitung
- Collagen Mantel Gewebekulturschalen und Flaschen: Typ I Kollagen aus Kalbsleder (0,1 g in 1 Liter; Sigma-Aldrich) abgeleitet. Die Kunststoffprodukte zu beschichten sind: T-25 Flaschen, 6 oder 12-Well-Platten, Geschirr (60 und 100 mm, BD Falcon) nach wie vor 1,2 beschrieben. Schütteln Sie die Kunststoffprodukte jede halbe Stunde, 4 Stunden auf eine gleichmäßige Beschichtung des Kollagens zu gewährleisten. Das Kollagen wird dann entfernt. Und die beschichtete Kunststoffprodukte ist dann erlaubt, in der Gewebekultur Kapuze mit dem UV-Licht und die Haube sowohl auf trockenen, um die Sterilität zu gewährleisten, und schließlich wieder verschlossen oder abgedeckt für eine spätere Verwendung.
- Bereiten Zellkulturmedium: 400ml DMEM (DMEM, hohe Glukose; Invitrogen), 50 mL Hitze inaktiviertes fötales Rinderserum (FBS, Invitrogen), 50 mL Pferdeserum (HS, Invitrogen) und 5 mL Hühnerembryo-Extrakt (CEE; Accurate Chemical Co. ) wird im Vakuum filtriert mit einem Einweg 0,22-um 500-ml sterile Filter-System (Corning) werden. Sterile Penicillin / Streptomycin-Lösung (Invitrogen) wird schließlich 100 Einheiten / ml zugesetzt werden. Die hergestellten Lösungen können bei 4 ° C für mindestens einen Monat gelagert werden. Diese Lösung wird verwendet, um die Zellen aus der Flasche lösen beim Aufteilen Kulturen oder der Vorbereitung der Zellen zur Transplantation.
- Warm up-Lösungen für die Zell-Trennung: Die folgenden Reagenzien müssen bis zu 37 ° C erwärmt werden vor ihrem Einsatz für die Zell-Trennung: Hanks Salzlösung (HBSS, Invitrogen), 0,2% (wt / vol) Kollagenase Typ XI (Sigma -Aldrich), mit einem Durchschnitt von 3.200 Kollagen Verdauung Einheiten pro ml HBSS; Dispase 2,4 units/1mL (Invitrogen), 0,5% (wt / vol) Trypsin (Invitrogen).
- Sterilisieren chirurgische Geräte in Vorbereitung: Chirurgischer Eingriff erfordern sterile OP-Instrumente, einschließlich: unterschiedlich große Zange, Mikro-Schere, Schere Iris und / oder Skalpellklingen. Zusätzlich, 15 und 50-mL Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (BD Falcon); Zellsieb (Porengröße 70 m) (BD Falcon), 18 -, 23 - und 27-Gauge-Nadeln (BD PrecisionGlide) und 10 - oder 20-ml sterile Spritzen (BD).
Schritt 2: Gewebeproben, Isolation und mechanischen Dissoziation 1-4
Die Gewebeproben werden unter einer sterilen Abzug durchgeführt und beinhalten frisch geernteten Sehnen und Muskulatur werden aus der Tibia oder soleus Muskeln der hinteren Gliedmaßen von Wildtyp-Mäusen (weiblich C57BL/6J, 4-5 Wochen alt oder jünger, Jackson erhalten Laboratory). Jede sichtbare Bindegewebe, Blutgefäße und Fettgewebe werden dann von der Biopsie-Proben entnommen. Die Gewebe der Sehnen und Muskeln werden dann vorsichtig unter einem chirurgischen Präpariermikroskop um Reste von Haut und Knochen entfernen identifiziert und in eine Schüssel mit kaltem (4 ° C) HBSS (ergänzt durch Zusatz von 5% der FBS). Die isolierten Gewebe werden dann separat auf Kollagen beschichtete Platten mit kaltem HBSS gelegt und wird zerkleinert (<1x1 mm 3) in einem groben Brei mit Mikro-Schere und / oder Skalpellklingen werden.
Schritt 3: Enzymatische Verdauung der Gewebe:
Das zerkleinerte Gewebe wird dann enzymatisch gespalten durch eine Reihe von Schritten 2,4,5
- Übertragen Sie die zerkleinerten Gewebes Schlämmen in einzelne 15-ml-Tuben und Zentrifuge bei ~ 3500 rpm bei 4 ° C für 5 Minuten.
- Entfernen Sie den Überstand mit HBSS gewaschen und wiederholen Sie die Zentrifugation erneut.
- Entfernen Sie den Überstand und verdauen diese Schlämme durch Zugabe von 10 ml vorgewärmtem 0,2% Kollagenase Typ XI (Sigma). Inkubieren für 60 Minuten bei 37 ° C unter ständigem vorsichtiges Schwenken der Röhrchen. Alternativ kann durch die Hand zu schütteln alle 10 min.
- Zentrifuge und resuspendieren diese Schlämme in 10 ml Dispase (2,4 Einheiten / ml, Gibco)-Lösung. Inkubieren für 45 Minuten bei 37 ° C, Schütteln mit der Hand oder sanft schaukelnden alle 10 min.
- Zentrifuge und resuspendieren diese Schlämme in 10 ml 0,2% Trypsin HBSS-Lösung. Inkubation wird basierend auf dem Ausmaß, in dem die einzelnen Zellen aus dem Gewebe, das durch die Beobachtung der Aufhängung unter dem Mikroskop durchgeführt werden können freigesetzt werden, variieren. Es ist nicht zu empfehlen, 30 Minuten bei 37 ° C überschreiten mit Umdrehen der Röhrchen oder sanft schaukelnden alle 10 min.
- Centrifuge die resultierende Zelles und Resuspension des Zellpellets in 10 ml Medium Proliferation (PM).
- Dissoziieren die Zellsuspension, indem der Extrakt durch eine Reihe von Nadeln. Die Zellen werden dann 2 mal durch eine 18G weitergegeben, dann 23G, und schließlich eine 27G Nadel.
- Pass der Zellextrakt durch eine 70-um Zellsieb.
Schritt 4: Preplating unterschiedliche Zellpopulationen auf die Zelladhäsion bei 1-3 basiert isolieren
- Zentrifuge und resuspendieren die Zellpellets in Proliferation Medium.
- Platte der Zelle Mischungen auf eine Kollagen-beschichtete T-25-Kolben (oder 60 mm-Schale) und markieren Sie ihn als PP1. Die Zellsuspension sollte besitzt eine große Anzahl von brechenden Kernen und andere Ablagerungen unter dem Mikroskop beobachtet werden.
- Bei 37 ° C in einer befeuchteten, 5% CO 2-Inkubator für 2 Stunden.
- Transfer nicht anhaftenden Zellen zu einem neuen Collagen-beschichteten T-25-Kolben (oder 60 mm-Schale) und markieren Sie als PP2. 5 ml PM in die Platte gekennzeichnet PP1. Die frühen anhaftenden Zellen, die in den Kolben befestigen sind meist Myofibroblasten 3.
- Bringen Sie den Kolben in den Inkubator für weitere 24 Stunden, Transfer nicht anhaftenden Zellen zu einem neuen Collagen-beschichteten T-25-Kolben (oder Gericht) und markieren Sie ihn als PP3. 5 ml Medium Proliferation in der Platte bezeichnet PP2. Diese anhaftenden Zellen, die zu dieser Kolben befestigen sind meist Fibroblasten 2,3.
- Zurück Flaschen in den Inkubator und wiederholen Sie den Vorgang in einem anderen 24 Stunden, bis der Bevölkerung PP6 erstellt. Halten Sie jede Gruppe von suspendierten Zellen und lassen sie sich zu vermehren und untersuchte sie regelmäßig mit einem inversen Mikroskop. PP3-PP4 sind meist Myoblasten während Muskel-Satelliten-Zellen sind oft vor allem in PP5 2 zu sehen.
- Die meisten der langsam anhaftenden Zellen in der Regel durch PP6 befestigen. In diesem Stadium erscheinen die Zellen kleine, runde, Lichtbrechung und sind sehr spärlich an Zahl und gelten als eine Stammzelle Bevölkerung 1,2 sein.
Schritt 5: Identifizierung und Ausbau von isolierten Stammzellen
- Die isolierte PP6 Zellen sind sehr gering an Zahl und müssen in FBS reiche Proliferation Medium (20% FBS in DMEM), die täglich gewechselt beibehalten werden. Die meisten Zellen im PP6 Kultur sterben in den folgenden 1-2 Wochen der Kultivierung, sondern eine große, gesunde PP6 Bevölkerung ist in der Regel nach einer weiteren 1-2 Wochen nach der Erweiterung geschaffen. Die Stammzellen aus Mäusen isoliert hoch ausdrückliche Stammzellen-Antigen 1 (SCA1), CD34, fetale Leber-Kinase 1 (Flk1) und andere Stammzellen Marker 1,2,6,7, die visualisiert werden über immunzytochemische Färbung kann. Diese Stammzellen weisen auch mehrere Differenzierung Kapazitäten 3,6,8.
- Die isolierten Zellen werden gepflegt und ausgebaut zu einem niedrigen Zelldichte in der Kultur (12-Well-Schalen bei 50-100 Zellen / Well oder <20-30% Konfluenz in der Flasche oder Schale), die Differenzierung 1,2 zu vermeiden. Sehr wenige Zellen bilden Klone während der Expansion, und diese geklonten Stammzellen können lange Zeit Proliferation (LTP) für jeden anderen Kompetenz-Studien unterzogen. Das geklonte Stammzellen auch speichern kann in flüssigem Stickstoff mit allgemeinen Zelle Speicherung Verfahren, z. B. PM-Medium mit 10% DMSO. Machen Sie eine Reihe von niedrigen Durchgang Aktien der Stammzellen für alle anderen Backup-Studien.
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Discussion
Es wurde erkannt, dass einige adulten Geweben mehrere Stammzellen enthalten. In den letzten Jahren des Studiums, haben Stammzellen in das weiche Gewebe des Bewegungsapparates, einschließlich Skelettmuskel und Sehne festgestellt. Das aktuelle Protokoll Einzelheiten eines Verfahrens, wie die modifizierte Vorbeschichtungszyklus Technik, die bereits erfolgreich in unserem Labor verwendet werden, um adulte Stammzellen aus Sehnen und Skelettmuskulatur zu isolieren bekannt. Mit dem modifizierten Vorbeschichtungszyklus Technik über den Zellen beschrieben werden können in mehrere Populationen auf ihre Hafteigenschaften an Kollagen beschichtet Kolben (Abbildung 1) eingeteilt werden. Fibroblasten und Myofibroblasten im Gewebe schnell gefunden, um das Kollagen beschichtet Flaschen innerhalb von 24-48 Stunden haften und werden zunächst von anderen Zellen in PP1-PP2 getrennt. Die myogene oder Endothelzellen an Kollagen beschichtet Kolben nach einem längeren Zeitraum, innerhalb 48-96 Stunden (PP3-PP5) haften und können geerntet und identifiziert werden, indem ihre Zelloberflächenmarker. Je später vorplattiert Zellen, 96 Stunden oder später (PP6), sind als adulte Stammzellen (Abbildung 2) betrachtet. Der verstorbene Vorbeschichtungszyklus Zellen erscheinen kleine, runde, durchscheinende und am Anfang ihrer Isolation und kann durch Durchflusszytometrie oder Immunzytochemie für ihre Expression von Stammzell-Antigen 1 (SCA1), CD34, fetale Leber-Kinase 1 (Flk1) charakterisiert werden, und anderen Stammzell-Marker (Abbildung 3). Die isolierten Stammzellen haben die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und experimentelle Studien haben ihre Multipotenz durch ihre Differenzierung zeigte sich in die drei Keimblätter: Mesoderm, Ektoderm und Entoderm 9. Mehrere Untersuchungen haben auch ergeben, dass diese Stammzellen in Zellen des Mesoderms Linie einschließlich Osteozyten, Adipozyten, Chondrozyten, und hämatopoetischen Zellen 6,8 unterscheiden. Andere Studien haben gezeigt, dass die adulten Stammzellen in Ektoderm Zelllinien differenzieren durch ihre Expression von neuronalen und glialen Zell-Marker und ihre Fähigkeit, Gliedmaßen Funktion zu verbessern, nachdem die peripheren Nerven hat 10 beschädigt worden. Diese isolierten adulten Stammzellen wurden für die Reparatur von verletzten und erkranktem Gewebe des Bewegungsapparates von Vorteil, und andere damit zusammenhängende In-vivo-Studien haben sich auf anderen Geweben wie Herz, Leber und Rückenmark sowie spezifische medizinische Bedingungen wie kleine intestinalen Submucosa und der Blase zu behandeln durchgeführt Belastungsinkontinenz 9.
Abbildung 1.
Abbildung 2.
Abbildung 3.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren sind dankbar für die Frau Haiying Pan und Herr Ian Bellayr für die technische Hilfe auf Zellisolation für den aktuellen Filmen und Mr. Kyle Holden und Mr. Jonathan Lucas für ihre Hilfe auf Folie bearbeiten. Vielen Dank an die folgende Liste von Personen, die mit der Entwicklung der modifizierten Vorbeschichtungszyklus Techniken in den letzten Jahren beteiligt waren: Drs. Burhan Gharaibeh, Baohong Cao, Deasy Bridget, Thomas R. Payne, Aiping Lu, Hairong Peng, Hideki Oshima, Bo Zeng, Xiaodong Mu, Kimimasa Tobita, Ron Jankowski, Makato Ikezawa. Wir sind dankbar für die technische Unterstützung von James H. Cummins, Ryan Pruchnic, Joseph Feduska, Rebecca C. Schugar, Haiying Pan und Jessica Tebbets. Der Autor möchte auch die finanzielle Unterstützung für diese Arbeit von der Gesellschaft für Muskeldystrophie (MDA), der National Institutes of Health (NIH), das Department of Defense (DOD), dem Kinderkrankenhaus von Pittsburgh von UPMC, das Department of anerkennen Orthopädische Chirurgie und der University of Pittsburgh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11995-073 | |
| FBS | Invitrogen | #10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | #26050-088 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | #CE650T-10 | |
| 100U ml penicillin/streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | #14190-250 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Invitrogen | #24020-117 | |
| Collagenase type XI 0.2%(wt/vol) | Sigma-Aldrich | #C7657 | |
| Dispase2.4U ml | Invitrogen | #17105-041 | |
| Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250) | Invitrogen | #15400-054 | |
| Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter | Sigma-Aldrich | #C-9791 | |
| DMSO | Sigma | #D-2650 |
References
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