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Biology

소프트 Musculoskeletal 조직에서 줄기 세포를 분리

doi: 10.3791/2011 Published: July 5, 2010
1,2,3,4, 1, 1,2,3,4,5

Summary

플라스크에 세포의 준수 속도에 따라 musculoskeletal 부드러운 조직에서 분리 성인 줄기 세포.

Abstract

성인 줄기 세포는 긴 재생 의료에서​​ 응용 프로그램에 관해서 논의했습니다. 성인 줄기 세포는 여러 혈통이 세포 분화 및 자기 갱신 능력을 받아야하기 때문에 그들의 인상적인 기능으로 부상하고 병에 걸린 조직을 치료에 대한 흥분의 큰 거래를 생성합니다. 가장 중요한 것은, 이러한 자질은 autologous 세포 이식 요법에 사용하기 위해 그들이 유리 만들었습니다. 현재 프로토콜은 musculoskeletal 시스템, 예를 들어, 힘줄 및 근육의 부드러운 조직 1의 수정된 preplate 기술에 독자를 소개합니다

Protocol

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일반적으로 전체 수정 preplate 절차는 준비 1-2 일, 기술적인 절차를 수행하기 1 주, immunocytochemistry와 세포 식별로부터 2-3 일 및 줄기 세포 인구 확장의 추가 2~3주이 필요합니다. 줄기 세포 배양에 필요한 장비는 벤치 - 최고 원심 분리기, CO 2 배양기, 층류 조직 문화 후드와 형광과 디지털 카메라가 장착된 거꾸로 현미경을 포함하는 다른 세포 배양 시스템의 비슷합니다. 분리된 줄기 세포는 복제 수 있으며 현재 또는 미래의 연구 1,2을위한 액체 질소의 장기 저장할 수 있습니다. 이 절차에 사용된 모든 시약 및 재료 살균하고 무균 처리합니다.

1 단계 : 준비

  1. 콜라겐 코트 조직 문화 요리와 flasks : 송아지 가죽 (일리터에 0.1 g, 시그마 - 알드리치)에서 파생된 유형 I 콜라겐. 코팅에 plasticware은 다음과 같습니다으로 1,2 앞에 설명한 T - 25 flasks, 6 또는 12 자 접시, 요리 (60 100mm, BD 팰컨). 부드럽게 콜라겐의도 코팅을 보장하기 위해 4 시간, plasticware에게 매 30 분마다 흔들어. 콜라겐 솔루션은 다음 제거됩니다. 그리고 코팅 plasticware는 다음 불임을 보장하기 위해, 자외선과 후드에 모두 조직 문화 후드의 건조 수 있으며, 마지막으로 recapped 또는 나중에 사용하기 위해 있었다.
  2. ;, 50mL 열 Inactivated 태아 소 혈청 (FBS, Invitrogen), 50mL 호스 세럼 (HS, Invitrogen), 5 ML의 칙의 배아 추출 (시, 정확한 화학 (주) 400mL DMEM (Invitrogen DMEM, 높은 혈당) : 세포 배양 매체 준비 ) 일회용 0.22 - μm의 500 ML 살균 필터 시스템 (코닝)를 사용하여 필터링 진공 것입니다. 무균 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션 (Invitrogen)가 마침내 100 단위 / ML 추가됩니다. 준비 솔루션은 최소한 한 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 이 솔루션은 술병에서 세포를 분리하는 데 사용되는 경우 분할 문화 또는 이식을위한 세포를 준비.
  3. 세포 분리를위한 솔루션을 따뜻하게 다음 시약 37을 예열해야 ° C 세포 분리 위해 사용하기 전에 : 행크의 버퍼 소금 솔루션 (HBSS, Invitrogen), 0.2 % (WT / 권) collagenase 타입 XI (시그마 Dispase 2.4 units/1mL (Invitrogen), 0.5 % (WT / 권) 트립신 (Invitrogen) ML HBSS 당 3,200 콜라겐 소화 단위의 평균 - 알드리치).
  4. 준비 수술 장비를 소독 : 서로 다른 크기의 포셉, 마이크로 가위, 가위 홍채 및 / 또는 메스 블레이드 : 수술을 포함한 살균 수술 도구가 필요합니다. 또한, 15 50 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브 (BD 팔콘), 셀 스트레이너 (기공 크기 70m) (BD 팔콘), 18 -, 23 - 27 - 게이지 바늘 (BD PrecisionGlide) 10 - 또는 20 - ML 무균 주사기 (BD).

2 단계 : 조직 biopsies, 절연 및 기계적 해리 1-4

조직 biopsies은 살균 문화 후드 아래에 수행됩니다 갓 수확 힘줄과 골격 근육을 포함은 야생 형 생쥐의 hindlimb (여성 C57BL/6J, 4-5 세 주 이하, 잭슨의 경골 또는 soleus 근육에서 얻을 수 있습니다 연구소). 모든 보이는 결합 조직, 혈관, 그리고 지방 조직은 다음 생검 샘플에서 제거됩니다. 힘줄과 근육의 조직은 다음 조심스럽게 피부와 뼈의 잔해를 제거하는 수술 해부 현미경으로 식별 및 포함된 차가운 (4 ° C) HBSS (FBS의 5 %를 추가로 보충).을 접시에 배치됩니다 분리된 조직은 다음 별도 추운 HBSS를 포함하는 콜라겐 코팅 요리에 위치하고 있으며 마이크로 가위 및 / 또는 메스 블레이드를 사용하여 굵은 슬러리에 (<1x1 mm 3) 다진 것입니다.

3 단계 : 조직의 효소 소화 :

다진 조직 단계 2,4,5 일련의를 통해 다음 효소 dissociated입니다

  1. 별도의 15 ML 튜브와 4 ~ 3,500 rpm으로 원심 분리기 ° C 5 분에 다진 조직 slurries을 전송합니다.
  2. 뜨는 제거 HBSS로 세척하고 다시 원심 분리를 반복합니다.
  3. 뜨는을 제거하고, prewarmed 0.2 % collagenase 타입 XI (시그마)의 10 ML을 추가하여 이러한 slurries을 소화. 37 60 분에 대해 품어 ° C 연속적으로 부드럽게 튜브 락을하면서. 또는 수동으로 매 10 분 흔들.
  4. 원심 분리기 10 ML dispase (2.4 단위 / ML, Gibco) 솔루션에서 이러한 slurries을 resuspend. 손을 떨고 또는 부드럽게 매 10 분 로킹, 37 ° C에서 45 분에 대해 품어.
  5. 0.2 % 트립신의 HBSS 용액 10 ML 이러한 slurries을 원심 분리기 다시 일시 중지합니다. 부화는 하나의 세포가 현미경으로 정학을 준수하여 수행할 수있는 조직에서 발표되는 수있는 정도에 따라 달라집니다. 그것은 반전 튜브 ° 37 30 분을 초과하는 C를 권장하거나 부드럽게 매 10 분 락을하지 않습니다.
  6. 결과 세포를 원심 분리기S 다시 중단 확산 중간 (PM) 10 ML에있는 세포 펠릿합니다.
  7. 바늘 일련의를 통해 추출을 통과하여 세포 현탁액을 떼어 놓다. 세포가 다음 18G 통해 23G를 2 번 통과하고, 마지막으로 27G 바늘입니다.
  8. 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 추출물 패스.

4 단계 : 세포 접착 률 1-3에 따라 서로 다른 세포 집단을 분리 Preplating

  1. 원심 분리기 및 확산 매체 셀 알약을 resuspend.
  2. 플레이트 셀룰라 콜라겐 - 코팅 T - 25 플라스크 (또는 60mm 요리)에 혼합하고 PP1로 표시합니다. 세포 현탁액은 현미경으로 굴절 핵 및 다른 파편의 큰 숫자를 가진으로 관찰해야합니다.
  3. 37 품어 ° 2 시간 동안 humidified 5 % CO 2 배양기에서 C.
  4. T - 25 플라스크 (또는 60mm 요리) 마크가 PP2 그대로 새로운 콜라겐 - 코팅에 nonadherent 세포를 전송합니다. PP1 표시 접시에 PM 5 ML을 추가합니다. 플라스크에 연결 초기 준수 세포가 대부분 myofibroblasts 삼아르.
  5. (또는 접시) T - 25 플라스크 새로운 콜라겐 - 코팅에 nonadherent 세포를 전송하고 PP3로 표시, 24 시간 동안 인큐베이터에 flasks를 반환합니다. PP2 표시된 판으로 확산 중 5 ML을 추가합니다. 이 플라스크에 연결이 준수 전지는 대부분 섬유아 세포 2,3입니다.
  6. 인큐베이터에 flasks를 반환하고 인구 PP6가 만들어 때까지 또 다른 24 시간의 절차를 반복하십시오. 정지 세포의 각 그룹을 유지하고 세포 분열 따위에 의해 번식하고 거꾸로 현미경을 사용하여 정기적으로 그들을 검토하도록 허용합니다. 근육 위성 세포가 자주 PP5 2 주로 볼 수있는 동안 PP3 - PP4은 대부분 myoblasts 있습니다.
  7. 천천히 준수 세포의 대부분은 일반적으로 PP6로 연결합니다. 이 단계에서는 세포가 작고, 둥근, 빛의 굴절을 표시하고 번호 매우 희박한 있으며 줄기 세포의 인구 1,2로 간주됩니다.

5 단계 : 식별 및 격리 줄기 세포의 확장

  1. 고립된 PP6 세포 수가 거의하고 매일 변경됩니다 FBS 풍부한 확산 중간 (20 % DMEM에 FBS)의 유지 관리해야합니다. 세포의 대부분은 culturing의 다음 1~2주 동안 PP6 문화 다이에 존재하지만, 대형, 건강 PP6 인구는 일반적으로 확장 추가 1-2주 후에 생성됩니다. 생쥐에서 분리된 줄기 세포는 고도로 줄기 세포 항원 1 (Sca1), CD34, 태아 간 키나제 1 (Flk1) 및 immunocytochemical 얼룩을 통해 시각 수있는 다른 줄기 마커 1,2,6,7을 표현. 이러한 줄기 세포는 여러 차별화 용량에게 3,6,8를 나타냅니다.
  2. 고립된 세포 유지와 차별화 1,2를 피하기 위해 (물론이나 술병이나 접시에 <20-30%의 합류 12 잘 50-100 세포에서 요리 /) 문화의 낮은 세포 밀도로 확장됩니다. 매우 세포 몇 확장 중에 클론을 형성하고, 이러한 복제 줄기 세포가 다른 능력 연구에 대한 오랜 시간이 확산 (LTP)를 받아야 수 있습니다. 복제된 줄기 세포는 10 % DMSO로 오후 중간 예를 들어, 일반적인 세​​포 저장 프로 시저를 사용하여 액체 질소에 저장할 수 있습니다. 다른 뒤로 최대 연구를위한 줄기 세포의 낮은 통과 주식의 번호를 확인합니다.

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Discussion

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그것은 일부 성인 조직이 여러 개의 줄기 세포가 포함되어있다는 사실을 인정했습니다. 연구의 지난 몇 년 동안, 줄기 세포는 골격근과 힘줄을 포함한 부드러운 musculoskeletal 조직에서 발견되었습니다. 성공적으로 힘줄과 골격 근육에서 성인 줄기 세포를 분리하기 위해 실험실에서 사용되었습니다 수정된 preplate 기술로 알려진이 현재의 프로토콜은 세부 절차를. 세포 위에서 설명한 수정된 preplate 기술을 사용하는 것은 콜라겐 코팅 flasks (그림 1) 자신의 접착 특성에 따라 여러 집단으로 나눌 수 있습니다. 조직 내에서 발견 섬유아 세포와 myofibroblasts 신속하게 24-48 시간 이내에 콜라겐 코팅 flasks을 준수하고 처음 PP1 - PP2에있는 다른 세포로부터 분리 수 있습니다. myogenic 또는 내피 세포가 48~96시간 이내에 긴 기간 (PP3 - PP5) 이후 콜라겐 코팅 flasks을 준수하고, 수확 및 세포 표면 마커에 의해 확인할 수 있습니다. 나중에 preplated 세포, 96 시간 또는 이상 (PP6)은 성인 줄기 세포 (그림 2)로 간주된다. 늦은 preplate 세포는 작은 원형, 그들의 고립의 시작 부분에서 반투명 나타나고 더욱 줄기 세포 항원 1 (Sca1), CD34, 태아 간 키나제 1 (Flk1) 자신의 표현 유동세포계측법 또는 immunocytochemistry 특징으로 수 있으며, 다른 줄기 세포 마커 (그림 3). mesoderm, ectoderm, 그리고 endoderm 9 : 절연 줄기 세포 자기 갱신과 실험 연구에 대한 용량이 세 가지 세균 층에 자신의 차별 화를 통해 multipotency를 증명하고있다있다. 여러 조사는 또한 이러한 줄기 세포는 osteocytes, adipocytes, chondrocytes, 그리고 조혈 세포 6,8 포함한 mesoderm의 혈통의 세포로 차별화하는 것으로 나타났다있다. 다른 연구는 성인 줄기 세포의 연결 및 glial 세포 마커와 주변 신경이 10 손상 후 사지 기능을 향상시키기 위해 자신들의 능력을 자신의 표현을 통해 ectoderm 세포 lineages로 차별화하는 것을 증명하고있다. 이러한 절연 성인 줄기 세포가 부상과 질병 musculoskeletal 조직을 수리를 위해 유익하고있어, 생체내 연구에 관련된 기타는 심장, 간, 그리고 척수뿐만 아니라 작은 창자 submucosa 및 치료 방광과 같은 특정 의료 조건을 포함한 다른 조직에서 수행되었습니다 스트레스 비뇨기 가득차 9.

그림 1
그림 1.

그림 2
그림 2.

그림 3
그림 3.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

저자는 현재 영화 '씨 카일 홀덴 및 슬라이드 편집 그들의 도움 씨 조나단 루카스에 대한 세포 격리 그들의 기술 도움을 양 Haiying 팬 씨와 이안 Bellayr의 크게 감사하고 있습니다. DRS : 지난 년 동안 수정된 preplate 기술의 개발에 관여했습니다 사람의 다음과 같은 목록에 많은 감사드립니다. Burhan Gharaibeh, BaoHong 카오, Deasy 브리짓, 토마스 R. 페인, Aiping 루, Hairong 펭, 히데키 오시마, 보 Zeng, Xiaodong 뮤, Kimimasa 도비타, 론 Jankowski, Makato Ikezawa. 우리는 제임스 H. 커밍, 라이언 Pruchnic, 요셉 Feduska, 레베카 C. Schugar, Haiying 팬과 제시카 Tebbets의 기술 지원에 감사하고 있습니다. 저자는 또한 근육질 영양 장애 협회 (MDA), 국립 보건원 (NIH), 국방부 (DOD), UPMC의 피츠버그의 아동 병원의학과이 작품에 대한 재정 지원을 인정하고 싶습니다 정형 외과 외과, 그리고 피츠버그 대학.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen #11995-073
FBS Invitrogen #10437-028
Heat-inactivated horse serum Invitrogen #26050-088
Chick embryo extract Accurate Chemical #CE650T-10
100U ml penicillin/streptomycin Invitrogen #15140-122
Dulbecco's PBS Invitrogen #14190-250
Hank's Buffered Salt Solution Invitrogen #24020-117
Collagenase type XI 0.2%(wt/vol) Sigma-Aldrich #C7657
Dispase2.4U ml Invitrogen #17105-041
Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250) Invitrogen #15400-054
Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter Sigma-Aldrich #C-9791
DMSO Sigma #D-2650

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References

  1. Gharaibeh, B. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
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Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011, doi:10.3791/2011 (2010).More

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