Summary
Isolera stamceller från rörelseorganens mjukdelar baserat på cellens anslutning hastighet till kolv.
Abstract
Adulta stamceller har länge diskuterats i avseende på deras tillämpning i regenerativ medicin. Adulta stamceller har genererat en hel del spänning för behandling av skadade och sjuka vävnader på grund av deras imponerande förmåga att genomgå flera härstamning celldifferentiering och deras egen förmåga att förnyas. Viktigast har dessa kvaliteter gjort dem fördelaktigt för att användas vid autolog cellterapi transplantation. Den nuvarande protokollet kommer att introducera läsaren till de ändrade preplate teknik där mjukdelar i rörelseapparaten, till exempel senor och muskler, är en
Protocol
I allmänhet krävs det fullständiga ändrade preplate förfarande 1-2 dagar av förberedelser, 1 vecka att utföra tekniska förfarandet, 2-3 dagars cell identifikation med immuncytokemi, och ytterligare 2-3 veckor av stamceller befolkningen expansion. Den utrustning som krävs för stamceller kultur är liknande den i andra system cellkulturer som innehåller en bänkbaserade centrifug, CO 2 inkubator, laminärt flöde vävnadskultur huva och ett inverterat mikroskop utrustat med fluorescens och en digitalkamera. De isolerade stamceller också kan klonas och kan lagras lång sikt i flytande kväve för nuvarande eller framtida studier 1,2. Alla reagenser och material som används för detta förfarande måste vara sterila och hanteras aseptiskt.
Steg 1: Förberedelser
- Kollagen päls vävnadskultur rätter och kolvar: Typ I kollagen som härrör från kalv huden (0,1 g i 1 liter, Sigma-Aldrich). Den plasten för att bestryka ingår: T-25 kolvar, 6 eller 12 hålsplattor, fat (60 och 100 mm, BD Falcon) som beskrivits tidigare 1,2. Skaka försiktigt plasten varje halvtimme, för 4 timmar för att säkerställa en jämn beläggning av kollagen. Den kollagen lösningen tas sedan bort. Och belagda plasten får sedan torka i vävnadsodling huva med UV-ljus och suffletten både för att säkerställa sterilitet, och till slut sitter på eller täckas för senare användning.
- Förbered cellkulturens medium: 400ML DMEM (DMEM, höga glukos, Invitrogen), 50ml värmeinaktiverad fetalt bovinserum (FBS, Invitrogen), 50ml hästserum (HS, Invitrogen) och 5 ml Chick Embryo Extract (CEE; Exakt Chemical Co ) kommer att vakuum filtreras med en disponibel 0,22-ìm 500-ml steril filtersystem (Corning). Sterila penicillin / streptomycin lösning (Invitrogen) kommer att läggas till slut 100 enheter / ml. Den beredda lösningar kan förvaras vid 4 ° C i minst en månad. Denna lösning används för att lossa cellerna från kolven vid delning kulturer eller förbereda celler för transplantation.
- Värm upp lösningar för cell isolering: Följande reagenser måste värmas upp till 37 ° C innan de används för cell isolering: Hanks buffrad saltlösning (HBSS, Invitrogen), 0,2% (vikt / vol) kollagenas-typ XI (Sigma -Aldrich), med ett genomsnitt på 3200 enheter kollagen matsmältning per ml HBSS; Dispase 2,4 units/1mL (Invitrogen), 0,5% (vikt / vol) trypsin (Invitrogen).
- Sterilisera kirurgisk utrustning i beredningen: kirurgiskt ingrepp kräver sterila kirurgiska instrument inklusive: olika storlek pincett, mikro-sax, iris sax och / eller skalpell blad. Dessutom, 15 och 50-mL polypropylen centrifugrör (BD Falcon), Cell sil (porstorlek 70 m) (BD Falcon), 18 -, 23 - och 27-gauge nålar (BD PrecisionGlide), och 10 - eller 20-ml sterila sprutor (BD).
Steg 2: vävnadsbiopsier, isolering och mekanisk dissociation 1-4
Vävnaden biopsier sker under en steril kultur huva och inkluderar nyskördade senor och muskler erhålls från skenbenet eller soleus muskler i bakdelen av vildtyp möss (Kvinna C57BL/6J, 4-5 veckors ålder eller yngre, Jackson Laboratory). Någon synlig bindväv, blodkärl och fettvävnad sedan bort från biopsi prover. Vävnader i senor och muskler är sedan noggrant identifierats under ett kirurgiskt dissekera mikroskop för att avlägsna rester av hud och ben och placeras i en skål med kallt (4 ° C) HBSS (kompletterad med lägg till 5% av FBS). De isolerade vävnader då de släpps ut på kollagen belagda rätter som innehåller kallt HBSS och kommer att malet (<1x1 mm 3) i en grov slurry med en mikro-sax-och / eller skalpell blad.
Steg 3: Enzymatisk nedbrytning av vävnader:
Det malda vävnaden är sedan enzymatiskt särskiljas genom en serie steg 2,4,5
- Överför det malda vävnaden slam i separata 15-ml rör och centrifugera vid ~ 3500 rpm vid 4 ° C i 5 min.
- Avlägsna supernatanten, tvätta med HBSS och upprepa centrifugering igen.
- Avlägsna supernatanten och smälta dessa slam genom att tillsätta 10 ml uppvärmd 0,2% kollagenas-typ XI (Sigma). Inkubera 60 minuter vid 37 ° C medan kontinuerligt mjukt gungande rören. Alternativt skaka hand var 10 min.
- Centrifugera och återsuspendera dessa slam i 10 ml dispase (2,4 enheter / ml, Gibco) lösning. Inkubera 45 minuter vid 37 ° C, skaka med händerna eller mjukt gungande var 10 min.
- Centrifugera och återsuspendera dessa slurry i 10 ml 0,2% trypsin HBSS lösning. Inkubation varierar beroende på i vilken utsträckning de enskilda cellerna frisätts från vävnaderna som kan utföras genom att observera suspenderade i mikroskop. Det rekommenderas att inte överstiga 30 minuter vid 37 ° C med att vända rören eller mjukt gungande var 10 min.
- Centrifugera den resulterande cellenS och återsuspendera cellpelleten i 10 ml spridning Medium (PM).
- Dissociera cellsuspensionen genom att skicka extraktet genom en serie av nålar. Cellerna skickas sedan två gånger genom en 18G, sedan ett 23G, och slutligen en 27G nål.
- Pass cellen extraktet genom ett 70-ìm cell sil.
Steg 4: Preplating att isolera olika cellpopulationer baserat på celladhesion takt 1-3
- Centrifugera och resuspendera cellen pellets i spridning Medium.
- Tavla cellen blandningar på en kollagen-belagd T-25 kolv (eller 60 mm maträtt) och markera den som PP1. Cellsuspensionen bör iakttas som besitter ett stort antal refraktiv kärnor och annat skräp under mikroskop.
- Inkubera vid 37 ° C i en fuktig, 5% CO 2 inkubator för 2 timmar.
- Överföring nonadherent celler till ett nytt kollagen-belagd T-25 kolv (eller 60 mm maträtt) och Mark är som PP2. Tillsätt 5 ml av PM i plattan märkt PP1. De tidiga följa celler som fäster kolven är mestadels myofibroblaster 3.
- Återgå kolvarna till inkubatorn i ytterligare 24 timmar, överföring nonadherent celler till ett nytt kollagen-belagd T-25 kolv (eller fat) och markera den som PP3. Tillsätt 5 ml spridning Medium i plattan märkt PP2. Dessa håller fast celler som fäster vid detta kolv är mestadels fibroblaster 2,3.
- Återgå kolvar till inkubatorn och upprepa proceduren i ytterligare 24 timmar tills befolkningen PP6 skapas. Behåll varje grupp av suspenderade celler och tillåta dem att föröka sig och undersöka dem regelbundet med ett inverterat mikroskop. PP3-PP4 är mestadels myoblasts medan muskel satellit celler ses ofta mestadels i PP5 2.
- De flesta av de långsamt håller fast cellerna fäster vanligen genom PP6. I detta skede cellerna verkar små, runda, lätt brytningsfel och är mycket sparsam i antal och anses vara en stamcell befolkning 1,2.
Steg 5: Identifiering och utbyggnad av isolerade stamceller
- Den isolerade PP6 blodkroppar är mycket få till antalet och måste hållas i FBS rika spridning Medium (20% FBS i DMEM) som ändras dagligen. De flesta av de celler som finns i PP6 kulturen dör under de följande 1-2 veckorna av odling, men en stor, frisk PP6 befolkningen skapas vanligtvis efter ytterligare 1-2 veckor för expansion. De stamceller som isolerats från möss uttrycka mycket antigen stamceller 1 (Sca1), CD34, lever hos foster kinas 1 (Flk1) och andra markörer stamceller 1,2,6,7 som kan visualiseras via immuncytokemiska färgning. Dessa stamceller uppvisar också flera differentiering kapacitet 3,6,8.
- De isolerade cellerna upprätthålls och utökas på en låg celltäthet i kultur (12-bra rätter på 50-100 celler / brunn eller <20-30% confluence i kolven eller skålen) för att undvika differentiering 1,2. Mycket få cellerna bildar kloner under expansion, och dessa klonade stamceller kan genomgå lång tid spridning (LTP) för någon annan kompetens studier. Den klonade stamceller kan också lagra i flytande kväve med hjälp av allmänna förfarandena cell lagring, t.ex. PM medium med 10% DMSO. Gör ett antal låga passagen lager av stamceller för andra studier igen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har konstaterats att en del vuxna vävnader innehåller flera stamceller. Under senare års studier har stamceller upptäckts i den mjuka muskuloskeletala vävnader, inklusive skelettmuskulaturen och senor. Det nuvarande protokollet närmare ett förfarande, kallat den modifierade preplate teknik, som har framgångsrikt använts i vårt laboratorium för att isolera adulta stamceller från senor och skelettmuskulatur. Med hjälp av ändrade preplate teknik som beskrivs ovan cellerna kan delas upp i flera populationer baserat på deras vidhäftningsförmåga mot kollagen belagda kolvar (Figur 1). Fibroblaster och myofibroblaster finns inom vävnaderna följer snabbt till kollagen belagda kolvar inom 24-48 timmar och är initialt separerade från andra celler i PP1-PP2. Den myogenic eller endotelceller följa kollagen belagda kolvar efter en längre tidsperiod, inom 48-96 timmar (PP3-PP5), och kan skördas och identifieras med sina markeringar cellytan. Den senare pläterad celler, 96 timmar eller senare (PP6), betraktas som vuxna stamceller (Figur 2). Den sena preplate celler, tycks små, runda och genomskinliga i början av deras isolering och kan dessutom karakteriseras med flödescytometri eller immuncytokemi för deras uttryck av stamceller antigen 1 (Sca1), CD34, lever hos foster kinas 1 (Flk1), och andra stamceller markörer (Figur 3). De isolerade stamceller har förmåga till förnyelse och experimentella studier har visat sin multipotency genom deras differentiering i tre groddblad: mesoderm, ektoderm och endoderm 9. Flera undersökningar har också visat att dessa stamceller differentieras till celler av mesoderm härstamning inklusive osteocytes, adipocyter, kondrocyterna och hematopoetiska celler 6,8. Andra studier har visat att vuxna stamceller differentieras till härstamningar ektoderm cellen genom deras uttryck av neuronala och gliacellsmarkörer markörer och deras förmåga att förbättra lem funktion efter det perifera nerver har skadats 10. Dessa isolerade vuxna stamceller har varit bra för att reparera skadade och sjuka muskuloskeletala vävnader, och andra relaterade in vivo-studier har utförts på andra vävnader, inklusive hjärta, lever, och ryggmärg samt särskilda medicinska tillstånd som tunntarmens submucosa och urinblåsa för att behandla ansträngningsinkontinens 9.
Figur 1.
Figur 2.
Figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna är starkt uppskattar Ms Haiying Pan och Ian Bellayr för teknisk hjälp på cell isolering för den aktuella filmer och Mr Kyle Holden och Mr Jonathan Lucas för deras hjälp med bild redigering. Ett stort tack till följande lista med personer som varit involverade i utvecklingen av den modifierade preplate tekniker under de senaste åren: Dr. Burhan Gharaibeh, Baohong Cao, DEASY Bridget, Thomas R. Payne, Aiping Lu, Hairong Peng, Hideki Oshima, Bo Zeng, Xiaodong Mu, Kimimasa Tobita, Ron Jankowski, Makato Ikezawa. Vi är tacksamma för tekniskt bistånd från James H. Cummins, Ryan Pruchnic, Joseph Feduska, Rebecca C. Schugar, Haiying Pan och Jessica Tebbets. Författaren vill också erkänna ekonomiskt stöd för detta arbete från muskeldystrofi Association (MDA), National Institutes of Health (NIH), Department of Defense (DOD), Barnens sjukhus i Pittsburgh i UPMC, Institutionen för Ortopedisk kirurgi, och University of Pittsburgh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11995-073 | |
| FBS | Invitrogen | #10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | #26050-088 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | #CE650T-10 | |
| 100U ml penicillin/streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | #14190-250 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Invitrogen | #24020-117 | |
| Collagenase type XI 0.2%(wt/vol) | Sigma-Aldrich | #C7657 | |
| Dispase2.4U ml | Invitrogen | #17105-041 | |
| Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250) | Invitrogen | #15400-054 | |
| Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter | Sigma-Aldrich | #C-9791 | |
| DMSO | Sigma | #D-2650 |
References
- Gharaibeh, B. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
- Qu-Petersen, Z. Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration. J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).
- Li, Y. &, Huard, J. Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle. Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).
- Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &, Sloper, J. C. Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse. J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).
- Lu, A. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).
- Lee, J. Y. Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing. J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).
- Cao, B. The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers. Gene Ther. 8, 627-637 (2001).
- Cao, B. Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential. Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).
- Huard, J. Regenerative medicine based on muscle stem cells. J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).
- Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &, Huard, J. Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells. J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).
