معالجة أرجل الحشرات للتنظير المجهري الفلوري: طريقة للحفاظ على الهياكل العصبية العضلية للتصوير

Overview

يصف هذا الفيديو طريقة لتشريح الساق البالغة Drosophila وإصلاحها وتركيبها مع الحفاظ على عضلتها العصبية سليمة لتحليل التصوير.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من غوان وآخرون.، تصور Drosophila الساق العصبية الحركية محاور عصبية من خلال لطيف الكبار، J. Vis. Exp. (2018).

1. تشريح الساق والتثبيت

1. تأخذ لوحة زجاجية متعددة الآبار وملء العدد المناسب من الآبار مع الإيثانول 70٪. إضافة 15-20 CO₂-تخدير الذباب (من أي من الجنسين وأي عمر) إلى كل بئر وباستخدام فرشاة، الداب بلطف الذباب في محلول الإيثانول حتى يتم غمر الذباب بالكامل.
   ملاحظة: هذه الخطوة هي لإزالة رهاب الماء من لطيف. لا تغسل لأكثر من 1 دقيقة، لأن هذا يزيد من الفلورسينس التلقائي للكفاح.
2. شطف الذباب 3 مرات مع 0.3٪ محلول المنظفات السطحية غير المؤينة في 1x الفوسفات المالحة المخزنة (PBS). الحفاظ على الذباب في هذا الحل لمدة 10 دقيقة على الأقل.
   ملاحظة: يتم إصلاح الساقين بشكل أفضل عند تضمين المنظفات ، والتي من المرجح أن تزيد من اختراق المثبت داخل الساق.
3. وضع لوحة متعددة الآبار على الجليد جنبا إلى جنب مع أنبوب من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA).
   ملاحظة: إعداد جديدة 4٪ PFA من 16٪ PFA حل الأسهم الحرة الإيثانول أمر بالغ الأهمية.
4. استخدام ملقط لإزالة الرأس والبطن من الذباب دون الإضرار الجزء الصدري أو الساقين.
   ملاحظة: إزالة البطن يجعل من السهل عقد ذبابة وتشريح الساقين.
5. تشريح الساقين من الجزء الصدري مع ملقط ووضع الساقين في الآبار التي تحتوي على 4٪ PFA. لهذا، دفع بلطف ولكن بحزم عند تقاطع كوكسا الصدر باستخدام غيض من ملقط غرامة حتى ينفصل الساق.
6. إصلاح الساقين في 4٪ PFA بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية (ما يقرب من 20 ساعة المجموع).
7. غسل الساقين مع 0.3٪ محلول المنظفات السطحية غير المؤينة في برنامج تلفزيوني 1x، 5x لمدة 20 دقيقة لكل منهما.
8. استبدل المخزن المؤقت للغسيل بمتوسط متصاعد. الحفاظ على الساق في تركيب المتوسطة لمدة يوم واحد على الأقل قبل تصاعد للسماح لتغلغلها الكامل في الساق.
   ملاحظة: إذا كان المتوسط المتصاعد لزجا للغاية ، فخفف الوسط المتصاعد إلى 80٪ مع برنامج تلفزيوني 1x لأن التغيير المفاجئ في اللزوجة يمكن أن يسبب انهيار السفاح وإلحاق الضرر بالهيكل العام للساق. اعتمادا على سائق Gal4 ، يمكن الحفاظ على الذباب لمدة 1 إلى 3 أسابيع عند 4 درجات مئوية في الوسائط المتصاعدة حتى التركيب.

2. الساق تصاعد

1. ضع ما يقرب من 20 ميكرولتر من 70٪ من الجلسيرول على الجانب الأيسر من شريحة المجهر وغطاء مع مربع 22 × 22 مم² coverslip (الشكل 1A، B). ماصة حوالي 10 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة على طول خط مواز وعلى مسافة صغيرة من الحافة اليمنى من هذا coverslip. إضافة آخر 30 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة كذلك على الجانب الأيمن من الشريحة (الشكل 1C).
   ملاحظة: عند تطبيق غطاء على الساقين (انظر أدناه) فإن المتوسطة المتصاعدة تنتشر بلطف تحت الغطاء وحول الساقين دون إزاحتها.
2. باستخدام ملقط غرامة رفع الساق من الحل ووضعها بلطف على المتوسطة المتصاعدة بالقرب من غطاء اليسار. تفعل الشيء نفسه بالنسبة لكل ساق ومحاذاتها من أعلى إلى أسفل (الشكل 1D).
   1. رفع ونقل الساقين في قطرة من المتوسط عقد بين كل من نصائح من ملقط. توجيه الساقين بطريقتين: الجانب الخارجي صعودا أو أسفل.
3. مرة واحدة جميع الساقين (يمكن تركيب ما يصل إلى 6-8 الساقين) هي محاذاة بشكل صحيح، ووضع غطاء الثاني على الساقين بحيث هذا coverslip تقع قليلا على الشكل 1E coverslip وضعت سابقا للسماح للمساحة بين coverslip والأنسجة ومنع الساقين من الحصول على التالفة (الشكل 1G).
   ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم الآبار اللاصقة أو الشمع التقويمي لخلق مساحة بين الغطاء والشريحة.
4. استخدام طلاء الأظافر لتأمين موقف من الأغطية في كل زاوية (الشكل 1واو).
   ملاحظة: الأنسجة جاهزة الآن للصورة.

Representative Results

الشكل 1: إجراء لتركيب الساقين على الشرائح المجهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium