형광 현미경 검사법을 위한 곤충 다리 처리: 화상 진찰을 위한 신경 근육 구조물을 보존하는 방법

Overview

이 비디오는 이미징 분석을 위해 신경 근육을 그대로 유지하면서 Drosophila 성인 다리를 해부, 수정 및 장착하는 방법을 설명합니다.

Protocol

이 프로토콜은 Guan 외에서발췌한 것입니다., 성인 큐티클을 통해 드로소필라 다리 운동 신경 축삭을 시각화, J. Vis. Exp. (2018).

1. 다리 해부 및 고정

1. 유리 멀티 웰 플레이트를 가지고 70 %의 에탄올로 우물의 적절한 수를 채웁니다. 각 우물에 15-20 CO_2-마취파리 (남녀 및 모든 연령)를 추가하고 브러시를 사용하여 파리가 완전히 잠길 때까지 에탄올 용액에 부드럽게 날아 갑니다.
   참고: 이 단계는 표피의 소수성을 제거하는 것이다. 이 큐티클의 자동 형광을 증가하기 때문에, 1 분 이상 세척하지 마십시오.
2. 1x 인산염 완충식식염(PBS)에서 0.3% nonionic 계면활성제 세제 용액으로 파리를 3회 헹구는 다. 이 솔루션에 파리를 최소 10분 동안 보관하십시오.
   참고: 다리 내부의 고정물의 침투를 증가시킬 가능성이 세제를 포함 할 때 다리가 더 잘 고정됩니다.
3. 4% 파라포름알데히드(PFA)의 튜브와 함께 멀티 웰 플레이트를 얼음 위에 놓습니다.
   참고: 16% PFA 에탄올 프리 스톡 솔루션에서 신선한 4% PFA를 준비하는 것이 중요합니다.
4. 집게를 사용하여 흉부 세그먼트 또는 다리를 손상시키지 않고 파리의 머리와 복부를 제거하십시오.
   참고: 복부를 제거하면 비행을 쉽게 잡고 다리를 해부할 수 있습니다.
5. 흉부 세그먼트에서 다리를 집게로 해부하고 다리를 4 % PFA가 함유 된 우물에 놓습니다. 이를 위해, 다리가 분리 될 때까지 미세 한 집게의 끝을 사용하여 coxa-thorax 접합에서 부드럽게 하지만 단단히 밀어 넣습니다.
6. 다리를 4 °C (총 약 20 시간)에서 하룻밤 동안 4 % PFA로 고정하십시오.
7. 1x PBS로 0.3% 니온 계면활성제 세제 용액으로 다리를 씻고, 5배는 각각 20분 동안 세척합니다.
8. 세척 버퍼를 장착 매체로 교체합니다. 다리에 완전한 침투를 허용하기 위해 장착하기 최소 하루 전에 다리를 장착 매체에 보관하십시오.
   참고: 장착 매체가 점성이 높은 경우 점도의 급격한 변화로 인해 큐티클이 붕괴되어 다리의 전체 구조를 손상시킬 수 있기 때문에 장착 매체를 1x PBS로 80%로 희석합니다. Gal4 드라이버에 따라 장착 대기시 4°C에서 1~3주 동안 파리를 보존할 수 있습니다.

2. 다리 마운팅

1. 현미경 슬라이드의 왼쪽에 약 20 μL을 놓고 사각형 22 x 22mm² 커버 슬립(그림 1A, B)로덮습니다. 이 커버슬립의 오른쪽 가장자리에서 평행선을 따라 작은 거리에서 장착 매체의 약 10 μL. 슬라이드의 오른쪽에 장착 매체의 또 다른 30 μL을 추가합니다(그림1C).
   참고: 다리 위에 덮개 슬립을 적용 할 때 (아래 참조) 장착 매체는 부드럽게 그들을 대체하지 않고 커버 슬립 아래와 다리 주위에 확산됩니다.
2. 미세 한 집게를 사용 하 여 용액에서 다리를 들어 올려 부드럽게 왼쪽 커버 슬립 근처 장착 매체에 넣어. 각 다리에 대해 동일한 작업을 수행하여 위에서 아래로 정렬합니다(그림1D).
   1. 손가락을 들어 올리고 두 끝 사이에 있는 중간 크기의 한 방울로 다리를 옮기십시오. 다리를 위아래로 좌우하는 두 가지 방법으로 다리를 방향을 지정합니다.
3. 모든 다리(최대 6~8개의 다리)가 적절히 정렬되면, 이 커버슬립이 이전에 배치된 커버슬립 도 1E에 약간 놓여 있어 커버슬립과 조직 사이의 공간을 허용하고 다리가 손상되는 것을 방지할 수 있도록 다리에 두 번째 커버슬립을 두번째 커버슬립을 설치하였다(도1G).
   참고: 또는 스티커 웰 또는 치열 교정 왁스를 사용하여 커버 슬립과 슬라이드 사이의 공간을 만들 수 있습니다.
4. 매니큐어를 사용하여 각모서리(도 1F)에서커버립의 위치를 확보합니다.
   참고: 조직은 이제 이미지 준비가되었습니다.

Representative Results

그림 1: 현미경 슬라이드에 다리를 장착하는 절차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium