处理昆虫腿荧光显微镜：一种保存神经肌肉结构成像的方法

Overview

此视频描述了一种解剖、修复和安装 德罗索菲拉 成人腿的方法，同时保持其神经肌肉完好无损，用于成像分析。

Protocol

本协议摘自关等人，可视化德罗索菲拉腿运动神经元轴突通过成人角质层，J.Vis.Exp.（2018年）。

1. 腿部解剖和固定

1. 拿一个玻璃多井板，用70%乙醇填充适量的井。在每口井中加入15-20个CO_2-麻醉苍蝇（无论性别和年龄），并使用刷子轻轻将苍蝇涂入乙醇溶液中，直到苍蝇完全被淹没。
   注： 这一步骤是去除地层的疏水性。不要洗超过1分钟，因为这会增加皮质层的自动荧光。
2. 用 0.3% 非离子表面活性剂洗涤剂溶液在 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中冲洗苍蝇 3 次。将苍蝇保存在此解决方案中至少 10 分钟。
   注： 腿部在包括洗涤剂时更固定，这可能会增加腿部固定剂的渗透率。
3. 在冰上放置一个多井板，以及一管4%的甲醛（PFA）。
   注： 从 16% PFA 乙醇免费库存解决方案中准备新鲜的 4% PFA 至关重要。
4. 使用钳子去除苍蝇的头部和腹部，而不会损坏胸部或腿部。
   注： 切除腹部可以更容易地抱住苍蝇并解剖腿部。
5. 用钳子解剖胸腔段的腿部，并将腿放在含有 4% PFA 的井中。为此，使用细钳尖轻轻但坚定地在考克斯-索拉克斯交界处推，直到腿部分离。
6. 在 4 °C （总共约 20 h） 的夜间修复腿部 4% PFA。
7. 用 1x PBS 中的 0.3% 非离子表面活性剂洗涤剂溶液清洗腿部，每次洗腿 5 次，每次 20 分钟。
8. 用安装介质替换洗涤缓冲器。将腿在安装前至少一天保持在安装介质中，以便其完全穿透腿部。
   注： 如果安装介质高度粘稠，用 1 倍 PBS 将安装介质稀释到 80%，因为粘度突然变化可能导致角质层坍塌并损坏腿部的整体结构。根据 Gal4 驱动程序的不同，苍蝇可以在安装介质的4°C下保存1至3周，直到安装。

2. 腿部安装

1. 将约 20μL 的 70% 甘油放在显微镜幻灯片的左侧，并盖上方形 22 x 22 mm² 盖片（图 1A，B）。Pipette 沿着一条平行于此盖滑的线路安装介质约 10 μL，距离此盖滑的右边缘有一小段距离。在幻灯片右侧再添加 30 μL 的安装介质（图 1C）。
   注： 在腿部涂抹盖片（见下文）时，安装介质将轻轻地在盖片下和腿部周围展开，而不会取代它们。
2. 使用细钳将腿从溶液中抬起，并轻轻地将其放在左盖唇附近的安装介质上。对每条腿都做同样的事，并从上到下对齐（图1D）。
   1. 在钳子的两个尖端之间，在一滴介质中抬起并转移腿部。以两种方式定位腿部：外部侧向上或向下。
3. 一旦所有腿部（最多可安装 6–8 条腿）均正确对齐，在腿部上放置第二个盖片，使盖片稍微放在先前放置的盖片图 1E上，以便在盖片和组织之间留出空间，并防止腿部受损（图 1G）。
   注： 或者，使用贴纸井或矫形蜡在盖滑和滑梯之间创造空间。
4. 使用指甲油固定每个角落的盖片位置（图 1F）。
   注： 组织现在已准备好成像。

Representative Results

图1：在显微镜幻灯片上安装腿部的程序。请单击此处查看此图的更大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium