Elaborazione delle gambe degli insetti per microscopia a fluorescenza: un metodo per preservare le strutture neuromuscolari per l'imaging

Overview

Questo video descrive un metodo per sezionare, fissare e montare la gamba adulta Drosophila preservando la sua neuromuscolatura intatta per l'analisi dell'imaging.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Guan et al., Visualizza gli assoni dei motoneuroni delle gambe Drosophila attraverso la cuticola adulta, J. Vis. Exp.

1. Dissezione e fissazione delle gambe

1. Prendi una piastra multi-pozzo di vetro e riempi il numero appropriato di pozzi con il 70% di etanolo. Aggiungere 15-20 mosche anestetizzate di CO₂(di entrambi i sessi e di qualsiasi età) ad ogni pozzo e, usando un pennello, tamponare delicatamente le mosche nella soluzione di etanolo fino a quando le mosche non sono completamente sommerse.
   NOTA: Questo passaggio è quello di rimuovere l'idrofobicità della cuticola. Non lavare per più di 1 minuto, perché ciò aumenta l'autofluorescenza della cuticola.
2. Risciacquare le mosche 3 volte con una soluzione detergente per tensioattivi non ionica allo 0,3% in soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS). Tenere le mosche in questa soluzione per almeno 10 minuti.
   NOTA: Le gambe sono meglio fissate quando si include il detergente, che è probabile che aumenti la penetrazione del fissativo all'interno della gamba.
3. Posizionare una piastra multi-pozzo sul ghiaccio insieme a un tubo di paraformaldeide al 4% (PFA).
   NOTA: La preparazione di PFA fresco al 4% da una soluzione di stock senza etanolo PFA al 16% è fondamentale.
4. Utilizzare le forcep per rimuovere la testa e l'addome delle mosche senza danneggiare il segmento toracico o le gambe.
   NOTA: La rimozione dell'addome rende più facile tenere la mosca e sezionare le gambe.
5. Sezionare le gambe dal segmento toracico con le forcep e posizionare le gambe nei pozzali contenenti il 4% di PFA. Per questo, spingere delicatamente ma saldamente alla giunzione coxa-torace usando la punta delle forcelle sottili fino a quando la gamba non si stacca.
6. Fissare le gambe in PFA al 4% durante la notte a 4 °C (circa 20 ore totali).
7. Lavare le gambe con una soluzione detergente per tensioattivi non ionica allo 0,3% in 1x PBS, 5x per 20 min ciascuno.
8. Sostituire il tampone di lavaggio con il mezzo di montaggio. Mantenere la gamba in mezzo di montaggio per almeno un giorno prima del montaggio per consentirne la completa penetrazione nella gamba.
   NOTA: Se il mezzo di montaggio è altamente viscoso, diluire il mezzo di montaggio all'80% con 1x PBS perché l'improvviso cambiamento di viscosità può causare il collasso della cuticola e danneggiare la struttura complessiva della gamba. A seconda del driver Gal4, le mosche possono essere conservate per 1 o 3 settimane a 4 °C nei supporti di montaggio fino al montaggio.

2. Montaggio delle gambe

1. Posizionare circa 20 μL di glicerolo al 70% sul lato sinistro di un vetrino del microscopio e coprire con un coverslip quadrato di 22 x²² mm 2(Figura 1A,B). Pipetta circa 10 μL di mezzo di montaggio lungo una linea parallela e ad una piccola distanza dal bordo destro di questo coverslip. Aggiungere altri 30 μL di mezzo di montaggio più avanti sul lato destro dello scivolo (Figura 1C).
   NOTA: Quando si applica un copriscivolo sulle gambe (vedi sotto) il mezzo di montaggio si diffonderà delicatamente sotto il copriscivolo e intorno alle gambe senza spostarli.
2. L'uso di forcep fini solleva la gamba dalla soluzione e la mette delicatamente sul mezzo di montaggio vicino al coperchio sinistro. Fare lo stesso per ogni gamba e allinearle dall'alto verso il basso (Figura 1D).
   1. Sollevare e trasferire le gambe in una goccia di mezzo tenuta tra entrambe le punte delle forcep. Orientare le gambe in due modi: lato esterno verso l'alto o verso il basso.
3. Una volta che tutte le gambe (è possibile montare fino a 6-8 gambe) sono correttamente allineate, mettere un secondo copriletto sopra le gambe in modo che questo copriletto poggia leggermente sul coverslip precedentemente posizionato Figura 1E per consentire spazio tra il coverslip e il tessuto e per evitare che le gambe si danneggino(Figura 1G).
   NOTA: In alternativa, utilizzare pozzi adesivi o cera ortodontica per creare spazio tra il copripasta e la diapositiva.
4. Utilizzare uno smalto per fissare la posizione dei copriparsi in ogni angolo (Figura 1F).
   NOTA: Il tessuto è ora pronto per l'immagine.

Representative Results

Figura 1: Procedura per montare le gambe su vetrini al microscopio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium