Processando pernas de insetos para microscopia de fluorescência: um método para preservar estruturas neuromusculares para imagem

Overview

Este vídeo descreve um método para dissecar, corrigir e montar a perna adulta Drosophila, preservando sua neuromusculatura intacta para análise de imagens.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Guan et al., Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp. (2018).

1. Dissecção e fixação de pernas

1. Pegue uma placa de vidro multi-poço e encha o número apropriado de poços com 70% de etanol. Adicione moscas anestesizadas de 15 a₂₀CO (de ambos os sexos e de qualquer idade) a cada poço e, usando um pincel, desabogue suavemente as moscas na solução de etanol até que as moscas estejam totalmente submersas.
   NOTA: Este passo é remover a hidroofobidade da cutícula. Não lave por mais de 1 min, pois isso aumenta a auto-fluorescência da cutícula.
2. Enxágüe as moscas 3 vezes com 0,3% de solução de detergente surfactante noniônico em 1x salina tamponada de fosfato (PBS). Mantenha as moscas nesta solução por pelo menos 10 minutos.
   NOTA: As pernas são melhor fixas quando incluem detergente, o que provavelmente aumentará a penetração do fixador dentro da perna.
3. Coloque uma placa multi-poço no gelo junto com um tubo de 4% de paraformaldeído (PFA).
   NOTA: A preparação de 4% de PFA fresco de uma solução de estoque livre de etanol PFA de 16% é fundamental.
4. Use fórceps para remover a cabeça e o abdômen das moscas sem danificar o segmento torácico ou as pernas.
   NOTA: Remover o abdômen facilita segurar a mosca e dissecar as pernas.
5. Dissecar as pernas do segmento torácico com fórceps e colocar as pernas nos poços contendo 4% de PFA. Para isso, empurre suavemente, mas firmemente na junção coxa-tórax usando a ponta de fórceps finos até que a perna se desprende.
6. Fixar as pernas em 4% PFA durante a noite a 4 °C (aproximadamente 20h no total).
7. Lave as pernas com 0,3% solução de detergente surfactante noniônico em 1x PBS, 5x por 20 min cada.
8. Substitua o tampão de lavagem por meio de montagem. Mantenha a perna em meio de montagem por pelo menos um dia antes da montagem para permitir sua penetração completa na perna.
   NOTA: Se o meio de montagem for altamente viscoso, diluir o meio de montagem para 80% com 1x PBS porque a mudança repentina na viscosidade pode causar o colapso da cutícula e danificar a estrutura geral da perna. Dependendo do motorista gal4, as moscas podem ser preservadas por 1 a 3 semanas a 4 °C em meios de montagem até a montagem.

2. Montagem da perna

1. Coloque aproximadamente 20 μL de 70% de glicerol no lado esquerdo de um slide de microscópio e cubra com um deslizamento quadrado de 22 x²² mm 2(Figura 1A,B). Pipeta cerca de 10 μL de meio de montagem ao longo de uma linha paralela e a uma pequena distância da borda direita deste deslizamento de cobertura. Adicione mais 30 μL de meio de montagem ainda mais no lado direito do slide(Figura 1C).
   NOTA: Ao aplicar uma mancha sobre as pernas (veja abaixo) o meio de montagem se espalhará suavemente sob a mancha de cobertura e ao redor das pernas sem deslocá-las.
2. Usando fórceps finos, levante a perna da solução e coloque-a suavemente no meio de montagem perto da tampa esquerda. Faça o mesmo por cada perna e alinhe-as de cima a baixo(Figura 1D).
   1. Levante e transfira as pernas em uma gota de médio entre as duas pontas dos fórceps. Oriente as pernas de duas maneiras: lado externo para cima ou para baixo.
3. Uma vez que todas as pernas (até 6-8 pernas podem ser montadas) estejam adequadamente alinhadas, coloque uma segunda mancha sobre as pernas de talão que este deslizamento de cobertura repousa ligeiramente sobre o deslizamento de cobertura anteriormente colocado Figura 1E para permitir espaço entre a tampa e o tecido e evitar que as pernas fiquem danificadas(Figura 1G).
   NOTA: Alternativamente, use poços de adesivos ou cera ortodôntica para criar espaço entre o deslizamento e o slide.
4. Use um esmalte para fixar a posição das tampas em cada canto(Figura 1F).
   NOTA: O tecido está pronto para ser imagem.

Representative Results

Figura 1: Procedimento para montar pernas em lâminas de microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium