Overview
Denne video beskriver en metode til at dissekere, fastsætte og montere Drosophila voksen ben og samtidig bevare sin neuromuskulature intakt til billedbehandling analyse.
Protocol
Denne protokol er et uddrag fra Guan et al.,Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp. (2018).
1. Ben dissektion og fiksering
- Tag en glas multi-well plade og fyld passende antal brønde med 70% ethanol. Tilsæt 15-20 CO2-bedøvedefluer (af begge køn og enhver alder) til hver brønd og ved hjælp af en børste, dup forsigtigt fluerne ind i ethanolopløsningen, indtil fluerne er helt nedsænket.
BEMÆRK: Dette trin er at fjerne neglebåndets hydrofobitet. Vask ikke i mere end 1 minut, fordi dette øger auto-fluorescens af neglebåndet. - Skyl fluerne 3 gange med 0,3% nonionisk overfladeaktivt vaskemiddelopløsning i 1x fosfat buffered saltvand (PBS). Hold fluerne i denne opløsning i mindst 10 minutter.
BEMÆRK: Benene er bedre fastgjort, når de inkluderer vaskemiddel, hvilket sandsynligvis vil øge indtrængen af fikseringsmidlet inde i benet. - Placer en multi-well plade på isen sammen med et rør på 4% paraformaldehyd (PFA).
BEMÆRK: Forberedelsen af frisk 4% PFA fra en 16% PFA ethanolfri lagerløsning er kritisk. - Brug pincet til at fjerne fluernes hoved og underliv uden at beskadige brystsegmentet eller benene.
BEMÆRK: Fjernelse af maven gør det lettere at holde fluen og dissekere benene. - Disseker benene fra brystsegmentet med pincet og læg benene i brøndene, der indeholder 4% PFA. Til dette skal du skubbe forsigtigt, men fast ved coxa-thorax krydset ved hjælp af spidsen af fine pincet, indtil benet løsner sig.
- Fastgør benene i 4% PFA natten over ved 4 °C (ca. 20 timer i alt).
- Vask benene med 0,3% nonionisk overfladeaktivt vaskemiddelopløsning i 1x PBS, 5x i 20 min hver.
- Udskift vaskebufferen med monteringsmedium. Hold benet i monteringsmedium i mindst en dag før montering for at give mulighed for dets fuldstændige indtrængning i benet.
BEMÆRK: Hvis monteringsmediet er meget tyktflydende, fortyndes monteringsmediet til 80% med 1x PBS, fordi den pludselige ændring i viskositet kan få neglebåndet til at kollapse og beskadige benets overordnede struktur. Afhængigt af Gal4-føreren kan fluer bevares i 1 til 3 uger ved 4 °C i monteringsmedier indtil montering.
2. Benmontering
- Der anbringes ca. 20 μL 70% glycerol i venstre side af et mikroskop og dæksel med kvadratisk 22 x 22 mm2 coverslip (Figur 1A,B). Pipette ca. 10 μL monteringsmedium langs en linje parallelt med og i en lille afstand fra højre kant af denne coverlip. Der tilsættes yderligere 30 μL monteringsmedium længere i højre side af diaset (figur 1C).
BEMÆRK: Ved påføring af en coverlip over benene (se nedenfor) vil monteringsmediet forsigtigt spredes under coverlipet og rundt om benene uden at fortrænge dem. - Brug fine pincet løfte benet fra opløsningen og forsigtigt sætte det på montering medium nær venstre coverlip. Gør det samme for hvert ben, og juster dem fra top til bund (Figur 1D).
- Løft og overfør benene i en dråbe medium holdt mellem begge spidser af pincet. Orientere benene på to måder: udvendig side op eller ned.
- Når alle ben (op til 6-8 ben kan monteres) er korrekt justeret, sætte en anden coverslip over benene, således at denne coverslip hviler lidt på den tidligere placerede coverslip Figur 1E for at give plads mellem coverlip og væv og for at forhindre benene i at blive beskadiget (Figur 1G).
BEMÆRK: Alternativt kan du bruge klistermærkebrønde eller ortodontisk voks til at skabe plads mellem coverlip og diaset. - Brug en neglelak til at sikre placeringen af coverlips på hvert hjørne(Figur 1F).
BEMÆRK: Vævet er nu klar til at blive afbildet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: Procedure for montering af ben på mikroskopdias. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm |
PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
Square 22 mm x 22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick |
Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |