Traitement des pattes d’insectes pour la microscopie par fluorescence : une méthode pour préserver les structures neuromusculaires pour l’imagerie

Overview

Cette vidéo décrit une méthode pour disséquer, fixer et monter la jambe adulte de Drosophila tout en préservant sa neuromusculature intacte pour l’analyse d’imagerie.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Guan et coll.,Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp. (2018).

1. Dissection et fixation des jambes

1. Prenez une plaque en verre multi-puits et remplissez le nombre approprié de puits avec 70 % d’éthanol. Ajouter 15-20 mouches anesthésiées au CO 2 (de sexe ou de tout âge) à chaque puits et à l’aide d’une brosse, tamponner doucement les mouches dans la solution_d’éthanoljusqu’à ce que les mouches soient complètement submergées.
   REMARQUE: Cette étape consiste à éliminer l’hydrophobicité de la cuticule. Ne pas laver pendant plus de 1 min, car cela augmente l’auto-fluorescence de la cuticule.
2. Rincer les mouches 3 fois avec 0,3% de solution de détergent non ionique surfactant en saline tamponnée 1x phosphate (PBS). Gardez les mouches dans cette solution pendant au moins 10 min.
   REMARQUE: Les jambes sont mieux fixées lors de l’inclusion de détergent, ce qui est susceptible d’augmenter la pénétration du fixatif à l’intérieur de la jambe.
3. Placez une plaque multi-puits sur la glace avec un tube de 4% de paraformaldéhyde (PFA).
   REMARQUE: La préparation d’un PFA frais de 4 % à partir d’une solution de stock sans éthanol PFA de 16 % est essentielle.
4. Utilisez des forceps pour enlever la tête et l’abdomen des mouches sans endommager le segment thoracique ou les jambes.
   REMARQUE: En enlevant l’abdomen, il est plus facile de tenir la mouche et de disséquer les jambes.
5. Disséquer les jambes du segment thoracique avec des forceps et placer les jambes dans les puits contenant 4% de PFA. Pour cela, poussez doucement mais fermement à la jonction coxa-thorax en utilisant la pointe des forceps fins jusqu’à ce que la jambe se détache.
6. Fixer les jambes en 4% de PFA pendant la nuit à 4 °C (environ 20 h au total).
7. Lavez les jambes avec 0,3% de solution de détergent surfactant nonionique en 1x PBS, 5x pendant 20 min chacun.
8. Remplacez le tampon de lavage par un support de montage. Gardez la jambe dans le milieu de montage pendant au moins un jour avant le montage pour permettre sa pénétration complète dans la jambe.
   REMARQUE: Si le milieu de montage est très visqueux, diluer le milieu de montage à 80% avec 1x PBS parce que le changement soudain de viscosité peut provoquer l’effondrement de la cuticule et endommager la structure globale de la jambe. Selon le pilote Gal4, les mouches peuvent être conservées pendant 1 à 3 semaines à 4 °C dans les supports de montage jusqu’au montage.

2. Montage des jambes

1. Placer environ 20 μL de 70 % de glycérol sur le côté gauche d’une lame de microscope et couvrir d’un couvercle carré de 22 x 22 mm² (figure 1A,B). Pipette environ 10 μL de milieu de montage le long d’une ligne parallèle à et à une petite distance du bord droit de ce coverslip. Ajouter encore 30 μL de support de montage plus loin sur le côté droit de la diapositive (Figure 1C).
   REMARQUE: Lors de l’application d’un coverslip sur les jambes (voir ci-dessous), le milieu de montage se répandra doucement sous le coverslip et autour des jambes sans les déplacer.
2. À l’aide de forceps fins soulever la jambe de la solution et doucement le mettre sur le milieu de montage près de la couverture gauche. Faites de même pour chaque jambe et alignez-les de haut en bas (Figure 1D).
   1. Soulevez et transférez les jambes dans une goutte de milieu maintenu entre les deux extrémités des forceps. Orientez les jambes de deux façons : côté externe vers le haut ou vers le bas.
3. Une fois que toutes les jambes (jusqu’à 6-8 jambes peuvent être montées) sont correctement alignées, mettez un deuxième coverslip sur les jambes de sorte que ce coverslip repose légèrement sur le coverslip précédemment placé figure 1E pour permettre l’espace entre le coverslip et le tissu et pour empêcher les jambes d’obtenir endommagé (Figure 1G).
   REMARQUE: Alternativement, utilisez des puits autocollants ou de la cire orthodontique pour créer de l’espace entre le coverslip et la diapositive.
4. Utilisez un vernis à ongles pour fixer la position des coverslips à chaque coin (Figure 1F).
   REMARQUE: Le tissu est maintenant prêt à l’image.

Representative Results

Figure 1 : Procédure de montage des jambes sur des toboggans au microscope. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium