蛍光顕微鏡用昆虫脚の処理:イメージングのための神経筋構造を保存する方法

Overview

このビデオでは、画像分析のために神経筋をそのまま維持しながら、 ショウジョウバエ の成人脚を解剖、固定、および取り付ける方法について説明します。

Protocol

このプロトコルは、Guanらからの抜粋であり、成人キューティクルを通してショウジョウバエ脚運動ニューロン軸索を視覚化する、J.Vis. Exp. (2018).

1. レッグ解剖と固定

1. ガラスのマルチウェルプレートを取り、70%エタノールで適切な数の井戸を充填します。15~20_CO2-麻酔ハエ(性別と年齢のいずれか)を各井戸に加え、ブラシを使用して、ハエが完全に水没するまでエタノール溶液に優しくハエを手を出します。
   注: この工程は、キューティクルの疎水性を除去する。これはキューティクルの自動蛍光を増加させるので、1分以上洗浄しないでください。
2. 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で0.3%非イオン界面活性剤洗浄剤溶液でハエを3回リンスします。この溶液中のハエを少なくとも10分間保管してください。
   注: 脚は洗剤を含む場合にはより良い固定され、脚の内側に固定剤の浸透が増加する可能性があります。
3. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)のチューブと一緒に氷の上にマルチウェルプレートを置きます。
   注: 16%のPFAエタノールフリーストック溶液から4%の新鮮なPFAの調製は重要です。
4. 鉗子を使用して、胸部のセグメントや脚を損傷することなく、ハエの頭と腹部を取り除きます。
   注: 腹部を取り除くことで、ハエを保持し、脚を解剖することが容易になります。
5. 胸部セグメントから鉗子で脚を解剖し、4%PFAを含む井戸に脚を入れます。このためには、脚が切り離されるまで細かい鉗子の先端を使用して、コクサ胸郭接合部で穏やかに、しかししっかりと押します。
6. 4°C(合計約20時間)で一晩4%PFAで脚を固定します。
7. 1x PBSで0.3%の非イオン界面活性剤洗剤溶液で脚を洗い、それぞれ20分間5倍にします。
8. 洗浄バッファーを取り付け媒体に交換します。脚への完全な浸透を可能にするために、取り付け前に少なくとも1日前に脚を取り付け媒体に入れないようにしてください。
   注: 取り付け媒体が高粘性である場合、粘度の急激な変化がキューティクルの崩壊を引き起こし、脚の全体的な構造を損傷する可能性があるため、1x PBSで取り付け媒体を80%に希釈します。 Gal4 ドライバによっては、マウントメディアで4°Cでハエを1~3週間保存できます。

2. レッグマウント

1. 顕微鏡スライドの左側に約20μLの70%グリセロールを置き、22 x 22 mm²カバースリップ(図1A,B)で覆います。このカバースリップの右端から平行に、そして小さい距離に沿って土台媒体の約10 μLのピペット。さらに30μLの取付け媒体をスライドの右側に追加します(図1C)。
   注: 脚の上にカバースリップを適用する場合(下記参照)、取り付け媒体は、カバースリップの下と脚の周りに、それらを置き換えることなく穏やかに広がります。
2. 細かい鉗子を使用して、溶液から脚を持ち上げ、左カバースリップの近くの取り付け媒体にそっと置きます。各脚に対して同じ操作を行い、上から下に配置します (図 1D)。
   1. 鉗子の両方の先端の間に保持される媒体の滴で足を持ち上げて移す。脚の向きを 2 つの方法で指定します: 外側面を上または下にします。
3. すべての脚(最大6〜8本の脚を取り付けることができます)が適切に配置されたら、このカバースリップが以前に配置されたカバースリップ図1Eにわずかに置かれて、カバースリップと組織の間のスペースを確保し、脚が損傷するのを防ぐために、脚の上に2番目のカバースリップを置きます(図1G)。
   注: または、カバースリップとスライドの間にスペースを作成するためにステッカーウェルまたは矯正ワックスを使用します。
4. マニキュアを使用して、各コーナーのカバーリップの位置を固定します(図1F)。
   注: 組織は今イメージする準備ができています。

Representative Results

図1:顕微鏡スライドに脚を取り付ける手順。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium